植物病理學(xué)研究方法第6章第2節(jié)

植物病理學(xué)基礎(chǔ)研究方法

（第6章第2節(jié))分子生物學(xué)技術(shù)在植物病原物鑒定、檢測(cè)中的應(yīng)用2/5/2023

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1第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在植物病原物鑒定、檢測(cè)中的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于一切生物學(xué)領(lǐng)域。在植物病理學(xué)研究中已應(yīng)用于植物病原物的鑒定、檢測(cè)，抗病基因的克隆以及抗病轉(zhuǎn)基因植物的培育中。本節(jié)中主要學(xué)習(xí)應(yīng)用PCR及相關(guān)技術(shù)進(jìn)行植物病原物的鑒定、檢測(cè)等問題。2/5/2023

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2第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在植物病原物鑒定、檢測(cè)中的應(yīng)用一.PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)（一）PCR的原理（二）PCR技術(shù)的操作（三）PCR技術(shù)的發(fā)展（四）PCR技術(shù)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用二.RAPD方法與SCAR標(biāo)記三.RFLP和AFLP技術(shù)四.核酸序列分析2/5/2023

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3一.PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)PCR（polymerasechainreaction）技術(shù)，即“聚合酶鏈反應(yīng)”，是體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，由美國科學(xué)家Mullis于1983～1985年發(fā)明。該技術(shù)模擬發(fā)生于生物細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程，無需繁瑣的基因克隆程序便可在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得大量拷貝的特異DNA片段，其步驟簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，為研究和分析基因提供了一種全新的方法，被譽(yù)為分子生物學(xué)技術(shù)上的一場(chǎng)革命，在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2/5/2023

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4（一）PCR的原理PCR的原理與體內(nèi)DNA復(fù)制的過程相似，它模擬DNA聚合酶在生物體內(nèi)的催化作用，在體外進(jìn)行特異DNA序列的聚合和擴(kuò)增。2/5/2023

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5生物體內(nèi)DNA分子的結(jié)構(gòu)和復(fù)制2/5/2023

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6DNA的結(jié)構(gòu)2/5/2023

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7DNA的結(jié)構(gòu):4種脫氧核苷酸組成ATGCATGC氫鍵磷酸二酯鍵3‵-OH3‵-OH3‵-OH使dNTP依次連接磷酸脫氧核糖2/5/2023

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8DNA復(fù)制的方向：新鏈只能從5’端′→3’端′5’端和3’端：磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端。DNA的核糖的羥基末端稱為3’端。3‵-OH使dNTP依次聚合2/5/2023

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9DNA復(fù)制的酶學(xué)底物:dNTP

即dTTP

dATP

dCTP

dGTP酶:DNA聚合酶(polymerase),

拓?fù)洚悩?gòu)酶,解螺旋酶,引物酶,DNA連接酶(ligase)。模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3‵-OH使dNTP依次聚合。蛋白因子：?jiǎn)捂溄Y(jié)合蛋白(SSB)。

眾所周知，ＤＮＡ是由四種堿基按互補(bǔ)配對(duì)原則（即腺嘌呤Ａ對(duì)胸腺嘧啶Ｔ，鳥嘌呤Ｇ對(duì)胞嘧啶Ｃ）組成的螺旋雙鏈。在細(xì)胞內(nèi)，ＤＮＡ復(fù)制時(shí)，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，引物酶合成一小段引物結(jié)合到ＤＮＡ模板上，最后，DNA聚合酶以這段引物為起點(diǎn)，合成與ＤＮＡ模板配對(duì)的新鏈。2/5/2023

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DNA復(fù)制的起始就是要解開雙鏈和生成引物。(一)DNA解成單鏈 由拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛超螺旋，解螺旋酶解開雙鏈，SSB結(jié)合到單鏈上使其穩(wěn)定。

生物體內(nèi)DNA分子的結(jié)構(gòu)和復(fù)制2/5/2023

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(二)引物合成引發(fā)體引導(dǎo)引物酶到達(dá)適當(dāng)?shù)奈恢煤铣梢?。引物長(zhǎng)度約為十幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸不等。引物的合成方向也是5′→3′方向。2/5/2023

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(三)延伸(elongation)：

復(fù)制體延DNA移動(dòng)，dNTP依次聚合。2/5/2023

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13生物體外DNA分子的復(fù)制

——PCR技術(shù)

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14PCR的3個(gè)基本反應(yīng)ＰＣＲ即是在體外模擬ＤＮＡ復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓所研究的ＤＮＡ片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個(gè)引物讓它們結(jié)合到ＤＮＡ模板的兩端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。PCR是由3個(gè)基本反應(yīng):

變性、退火、延伸

3步反應(yīng)周期反復(fù)循環(huán)。每循環(huán)一次所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板。20次PCR循環(huán)將產(chǎn)生約一百萬倍(220)的擴(kuò)增產(chǎn)物。2/5/2023

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15變性（雙鏈DNA解鏈成單鏈）1.變性：將反應(yīng)體系置高溫下(91～94℃,1min),DNA雙螺旋的氫鍵斷裂(變性)，形成單鏈DNA。模板DNA、引物1、引物2、dNTP和TaqDNA聚合酶、Mg2+、Buffer

模板DNA：含有待擴(kuò)增區(qū)域的DNA

特異性引物:與模板DNA待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列互補(bǔ)的寡核苷酸

dNTP：帶有A、T、G、C的單核苷酸（脫氧核苷三磷酸）

TaqDNA聚合酶：催化DNA復(fù)制的酶

Mg2+:保證DNA復(fù)制的酶活性

Buffer：緩沖液2/5/2023

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16退火（按堿基配對(duì)原則結(jié)合形成雙鏈區(qū)）2.退火：使溫度下降

(37～65℃,1min)，PCR反應(yīng)體系中的引物與模板鏈3’端互補(bǔ)區(qū)退火（按堿基配對(duì)原則結(jié)合形成局部雙鏈區(qū)），引物與模板結(jié)合。由于DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動(dòng)（引導(dǎo)）新鏈的合成（在生物體內(nèi)也如此），于是，TaqDNA聚合酶將單核苷酸從引物的3′端引入，催化磷酸二脂鍵生成。引物的關(guān)鍵作用有二：①啟動(dòng)新鏈的合成；②引物的退火位點(diǎn)決定新DNA鏈的起點(diǎn)。2/5/2023

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17延伸（DNA合成鏈的延伸）3.延伸；72℃，2min,在適當(dāng)?shù)木彌_液中，Mg2+存在條件下，Taq

DNA聚合酶按模板的堿基順序不斷引入4種dNTP（脫氧核苷三磷酸）合成互補(bǔ)鏈，按5′→3′的方向不斷延伸。由于兩引物都是按與擴(kuò)增區(qū)段兩端序列彼此互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)的，在每一條新合成的DNA鏈上都具有新的引物結(jié)合位點(diǎn)。2/5/2023

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18從退火

到延伸有人問：退火時(shí)為什么引物與模板雜交，而模板雙鏈不復(fù)性呢？原因：一是相對(duì)模板DNA來說引物的量大；二是模板DNA比引物分子量大且復(fù)雜。所以在復(fù)性時(shí)，引物與模板在局部形成雜交鏈的機(jī)會(huì)比模板復(fù)性要大得多。引物1引物1引物2引物22/5/2023

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19PCR擴(kuò)增過程2/5/2023

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201234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR擴(kuò)增過程2/5/2023

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21PCR儀——基因體外擴(kuò)增儀；熱循環(huán)儀

2/5/2023

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22（二）PCR技術(shù)的操作冰上向管中依次加入下列試劑：

總體積

25μl

10×Buffer2.5μl

MgCl22mmol/L

dNTP

0.2mol/L（4種dNTP各1/4）

引物

0.2μmol/L

模板

10ng

Taq酶

2μL

雙蒸水補(bǔ)至終體積2/5/2023

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23微量移液器的使用方法

1)吸進(jìn)液體時(shí)按到第一檔，垂直進(jìn)入液面幾毫米。緩慢松開控制按鈕，防止液體進(jìn)入吸頭過速會(huì)導(dǎo)致液體倒吸人移液器內(nèi)部吸入體積減少。2)打出液體時(shí)貼壁并有一定角度，先按到第一檔，稍微停頓1s后，待剩余液體聚集后，再按到第二檔將剩余液體全部壓出。2/5/2023

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24反應(yīng)循環(huán)參數(shù)反應(yīng)管放入PCR儀中，按如下程序操作：

94℃預(yù)變性

2～5min94℃變性

1min

45～62℃退火

1min72℃延伸

2min

循環(huán)30次

72℃延伸

7min

（以保證擴(kuò)增出來的片段都是全長(zhǎng)的）循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存2/5/2023

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25PCR條件的優(yōu)化：在PCR反應(yīng)中主要影響因素有：模板、Mg2+

、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、引物、TaqDNA聚合酶、溫度循環(huán)參數(shù)。2/5/2023

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26⑴模板量模板的純度及量對(duì)反應(yīng)有重要的影響。一般含量在2～100ng均能獲得目標(biāo)產(chǎn)物。模板的量過少可能PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中不能被檢測(cè)出來；模板量太大也會(huì)影響PCR的效率，并且會(huì)出現(xiàn)非特異產(chǎn)物。模板可用總DNA，一般不需高度純化，甚至煮沸細(xì)胞釋放出DNA也可作模板。2/5/2023

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27⑵Mg2+濃度Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。不同的引物-模板系統(tǒng)，最適合的Mg2+濃度可能不同。

Mg2+濃度過低，酶活力顯著降低；濃度過高催化非特異擴(kuò)增。通常適合的Mg2+為0.5～5.0mmol/L，需做預(yù)備實(shí)驗(yàn)來選定。2/5/2023

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28⑶dNTP濃度反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20～200μmol/L時(shí)，PCR產(chǎn)物量、特異性與合成忠實(shí)性間的平衡最佳。適宜dNTP濃度可根據(jù)靶序列長(zhǎng)度和堿基組成來確定。2/5/2023

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29⑷引物濃度一般PCR體系中引物的終濃度為0.2～0.5μmol/L，在此范圍內(nèi)，PCR產(chǎn)物量基本相同。但引物量低于0.2μmol/L時(shí)，PCR產(chǎn)物量降低；引物量過高會(huì)促使非特異產(chǎn)物的合成，還會(huì)增加引物二聚體的形成。2/5/2023

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30⑸退火溫度退火溫度直接影響擴(kuò)增的特異性，退火溫度高則擴(kuò)增特異性高，但PCR產(chǎn)物量低；退火溫度過低易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。需進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)選擇適宜退火溫度。2/5/2023

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31⑹TaqDNA聚合酶濃度在其它參數(shù)最佳時(shí)，100μL反應(yīng)液含1～2.5μL

TaqDNA聚合酶為佳。如果酶濃度太高易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶；酶濃度過低時(shí)，則靶序列產(chǎn)量很低。

2/5/2023

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32熱啟動(dòng)可提高特異性、擴(kuò)增效率采用熱啟動(dòng)可提高特異性，還可提高擴(kuò)增效率。方法為：反應(yīng)體系的最后1種成分（如TaqDNA聚合酶）暫不加入，加熱到80℃或更高再加入，接著將樣品管加熱到94℃直接進(jìn)入PCR循環(huán)。2/5/2023

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33分子生物學(xué)技術(shù)重要參考書2/5/2023

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34DNA的提取和檢測(cè)為進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，首先要進(jìn)行DNA的提取和檢測(cè)。DNA提取的不同方法：

CTAB

、SDS、尿素法、SDS～CTAB、濃鹽法等紫外吸收法測(cè)定核酸種類、含量2/5/2023

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35DNA提取的方法2/5/2023

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36細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸植物DNA提取的基本過程2/5/2023

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37植物DNA提取的不同方法CTAB（溴代十六烷基三甲胺）法

CTAB是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜并能與核酸形成復(fù)合物，便于DNA的抽提；還可保護(hù)DNA免受內(nèi)源核酸酶的降解，使蛋白質(zhì)變性而沉淀。1×CTAB（溴代十六烷基三甲胺）DNA提取液

1%（W:V）CTAB50mmol/LTris-HCl（pH8.0）

10mmol/LNa2EDTA0.7mol/LNaClSDS（十二烷基硫酸鈉）法可溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀。

濃鹽法（RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而DNA難溶其中，據(jù)此特性可將兩者分開。DNA易溶于0.5～1mol/L的NaCl溶液中，因此可利用1mol/L的NaCl溶液提取DNA。）尿素法：尿素是一種變性劑，如6～8mol/L尿素為中強(qiáng)變性劑。蛋白質(zhì)在受熱或在高濃度的尿素、鹽酸胍（8M脲和5M鹽酸胍）等化學(xué)試劑存在下會(huì)喪失活性，該現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。2/5/2023

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38植物DNA提取方法的要點(diǎn)細(xì)胞破碎→細(xì)胞（勻）漿可用機(jī)械破碎法：如研磨。核酸分離、純化應(yīng)在0～4℃，以防核酸變性或降解。Tris緩沖液

Tris的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，作用是保持溶液的電中性及pH。在提取液中加入適量EDTA或檸檬酸鹽可抑制Dnase活性，又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離。β-巰基乙醇具還原劑性質(zhì)，能防止過氧化物對(duì)分離物的破壞、分解。從核酸樣品中除去蛋白質(zhì)時(shí)常常使用苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)。苯酚/氯仿可與水作用能破壞蛋白質(zhì)分子周圍的水膜，同時(shí)改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性溶解度降低而沉淀析出。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。加入異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。異丙醇、乙醇可選擇性的沉淀DNA，而RNA仍留在溶液中。2/5/2023

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39抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA。氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少泡沫產(chǎn)生，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。一般采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成）。2/5/2023

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40實(shí)驗(yàn)材料研磨加入提取液

獲得植物汁液研缽及其它容器應(yīng)事先高壓滅菌，再烘干。植物汁液加入離心管2/5/2023

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41DNA提取的重要儀器

高速離心機(jī)離心管加入離心機(jī)前必須對(duì)離心管進(jìn)行配平衡2/5/2023

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42打開離心機(jī)的蓋子離心管放入離心機(jī)轉(zhuǎn)子離心管的正確放置插好離心管2/5/2023

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43紫外吸收法測(cè)定核酸種類及含量原理：DNA和RNA的吸收峰在260nm處。蛋白質(zhì)由于含有芳香族氨基酸，吸收峰在280nm處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時(shí)對(duì)核酸的紫外測(cè)定影響不大。RNA的260nm和280nm吸收的比值在2.0以上，DNA的260nm和280nm吸收的比值在1.9左右，當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)比值即下降(比值≥1.8，表示蛋白質(zhì)含量不超過0.3％)。在實(shí)際測(cè)定中，將樣品稀釋成每mL含5～50μg核酸的濃度，可利用在260nm下的吸收值來求出核酸的濃度。DNA濃度（μg/mL）＝A260/0.020/L*稀釋倍數(shù)式中：A260為260nm下的吸收值；L為比色池厚度，一般為1或0.5；0.020為每mL溶液內(nèi)含1μgDNA鈉鹽的吸光度.紫外可見光分光光度計(jì)2/5/2023

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44瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物由于DNA核酸分子比蛋白質(zhì)分子大得多，通常采用有較大孔徑的瓊脂糖凝膠來分離核酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中會(huì)向正極移動(dòng)。試劑和儀器水平電泳槽、電泳儀2/5/2023

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45PCR儀——基因體外擴(kuò)增儀PCR儀配套用品2/5/2023

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46PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

AnaysingtheresultsofaPCRbyagarosegelelectrophoresis待分析的DNA樣本2/5/2023

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47水平電泳槽、電泳儀2/5/2023

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48

制備凝膠板

2/5/2023

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49加樣2/5/2023

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50水平電泳圖示凝膠板上的電泳條帶凝膠板上的電泳前端用溴酚藍(lán)指示加樣孔2/5/2023

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51電泳分離不同大小的DNA片斷2/5/2023

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52凝膠成像儀凝膠板上的電泳條帶2/5/2023

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53（三）PCR技術(shù)的發(fā)展以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)與其它最新技術(shù)相結(jié)合,進(jìn)一步發(fā)展了反轉(zhuǎn)錄PCR

、免疫捕捉PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重聚合酶鏈反應(yīng)等復(fù)合PCR技術(shù)。這些方法提供了更快捷、特異、準(zhǔn)確、高效檢測(cè)植物病原物的方法.2/5/2023

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541.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）1.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）目前PCR技術(shù)只能擴(kuò)增DNA模板，而TaqDNA聚合酶不能以RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。利用逆轉(zhuǎn)錄酶能將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的特性，通過合適的引物，將RNA（一般為mRNA)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后，通過PCR技術(shù)，將痕量的cDNA擴(kuò)增成大量的雙鏈DNA。這種在RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增稱為RT-PCR

（ReversetranscriptionPCR,簡(jiǎn)稱RT-PCR）。大多數(shù)植物病毒基因組為RNA，為檢測(cè)植物病毒，就需要應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成互補(bǔ)的第一鏈cDNA，之后進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。cDNA：互補(bǔ)DNA，具有DNA的功能，且其中沒有內(nèi)含子。2/5/2023

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55逆轉(zhuǎn)錄示意圖cDNA鏈合成,互補(bǔ)mRNA鏈，一般利用polyT作引物，也可用特異性的序列作為引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTAGGAGTTTTTTTTTTTTTTT逆轉(zhuǎn)錄polyT引物2/5/2023

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56反轉(zhuǎn)錄PCR原理示意圖逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶RNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA這個(gè)步驟與轉(zhuǎn)錄是相反的，因此叫逆轉(zhuǎn)錄酶。

逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶。至少具有以下三種活性：

1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；

2、Rnase水解活性：水解RNA/DNA雜合體中的RNA；

3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA。Taq

酶

2/5/2023

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57反轉(zhuǎn)錄PCRcDNA2/5/2023

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58RT～PCR檢測(cè)番木瓜環(huán)斑病毒電泳結(jié)果2/5/2023

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592.免疫捕捉PCR（IC-RTPCR）特異性抗體抗原2.免疫捕捉PCR（IC-RTPCR）是根據(jù)ELISA的原理，直接從植物粗提液中進(jìn)行免疫捕捉病毒，目的在于濃縮和純化病毒粒子，之后再利用RT-PCR

檢測(cè)目的片斷?；玖鞒蹋ǚ磻?yīng)在0.5mL離心管中進(jìn)行）：包被抗體→捕捉抗原→病毒核酸釋放（98℃，3min）→反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系離心管反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)→PCR擴(kuò)增2/5/2023

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60免疫捕捉PCR有以下優(yōu)點(diǎn)免疫捕捉PCR具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)在PCR擴(kuò)增前，有免疫捕捉的過程以及引物的高度特異性,提高了檢測(cè)的靈敏度（上百倍）。ELISA一般能夠檢測(cè)到的病毒濃度是1ng/mL,但是IC-RTPCR一般只需要1～10pg/mL.(2)能直接從植物粗提液中檢測(cè)病原物，而省去PCR模板的純化,這對(duì)于核酸提取困難的樣品特別適用。利用抗原與抗體的結(jié)合，能除去植物粗提液中的PCR抑制物。2/5/2023

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613.實(shí)時(shí)熒光定量PCR3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimefluorescentQuantitativePCR，RT-FQPCR)是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，簡(jiǎn)稱FQ-PCR。該技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如：SYBRGREEN）或特異性的熒光探針（如：Taqman探針），實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光量的變化。獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號(hào)（閾值）時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)CT值（CycleThreshold）；通過將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與其濃度的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量樣品的濃度。FQ-PCR是PCR反應(yīng)一面進(jìn)行，機(jī)器一面利用螢光偵測(cè)技術(shù)與計(jì)算機(jī)分析技術(shù)記錄PCR的反應(yīng)結(jié)果，當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果就立即呈現(xiàn)。2/5/2023

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62

SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光。復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen法優(yōu)點(diǎn)：使用方便不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針，非常靈敏，便宜。SYBRGreen法缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1

SYBRGreen法2/5/2023

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63實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法2TaqMan法探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)

，發(fā)生FRET光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團(tuán)

淬滅劑

延伸時(shí)，Taq酶水解探針，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號(hào)

Taq發(fā)出熒光光另一波長(zhǎng)的光在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，反應(yīng)體系添加“熒光雙標(biāo)記探針”，探針的5′端為熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端為熒光淬滅基團(tuán)，兩者構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，5′端熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光可被熒光淬滅基團(tuán)吸收掉，轉(zhuǎn)化為其他波長(zhǎng)的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET。在目標(biāo)DNA擴(kuò)增過程中，探針?biāo)?，熒光素和淬滅劑分開，淬滅劑對(duì)熒光素的抑制作用消失，從而引起報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)的增長(zhǎng)。由于探針必須遇到模板才能實(shí)現(xiàn)水解，故非特異性擴(kuò)增不會(huì)被檢測(cè)。2/5/2023

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64實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法3分子信標(biāo)法探針雜交到DNA模板光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)DNA模板淬滅劑

莖

環(huán)光淬滅在目標(biāo)DNA擴(kuò)增過程中，分子信標(biāo)型探針構(gòu)型變化，熒光素和淬滅劑分開，淬滅劑對(duì)熒光素的抑制作用消失，從而引起報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)的增長(zhǎng)。標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針：環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成2/5/2023

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65實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)起始DNA的定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)起始DNA的定量方法為：原理：初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（Ct閾值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少。Ct值和初始DNA量的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。制定標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和初始DNA量的對(duì)數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的Ct值就可準(zhǔn)確定出起始DNA數(shù)量。Ct值（Cyclethreshold）

：指在PCR循環(huán)過程中熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值的循環(huán)次數(shù)。經(jīng)數(shù)學(xué)證明，Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)的關(guān)系：N＝N0(1+E)n

logN=nlog(1+E)+logN0

n=(logN0-logN)/log

(1+E)Ct

=A

+B·logN02/5/2023

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664.多重聚合酶鏈反應(yīng)4.多重聚合酶鏈反應(yīng)（MultiplexPCR）不同的植物病毒或其它病原物可能會(huì)同時(shí)侵染同一種植物，如要逐個(gè)檢測(cè)，操作較為繁瑣。多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)可在一次PCR反應(yīng)中，同時(shí)加入幾對(duì)特異性引物(要注意各引物比例適當(dāng))，從而同時(shí)擴(kuò)增、檢測(cè)出不同的病原物(DNA或者RNA).這就為檢測(cè)工作提供了極大的便利。2/5/2023

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67（四）PCR技術(shù)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用1.檢測(cè)病原物的種類2.檢測(cè)病原物的數(shù)量3.分析轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)2/5/2023

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68檢測(cè)病原物種類的辦法找到某種病原物的特異性核酸序列，對(duì)待檢病原的核酸進(jìn)行該序列的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果陽性，表示待檢病原為特定病原物；擴(kuò)增結(jié)果陰性，表示待檢病原非特定病原物。2/5/2023

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691.檢測(cè)病原物的種類王杰等（2005）建立了能直接以大豆干種子為檢測(cè)對(duì)象的SMV快速、靈敏、特異的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，從而為防治大豆花葉病提供了關(guān)鍵技術(shù)。Jansen等在檢測(cè)ToMV(Tomatomosaicvirus)和TMV(Tobaccomosaicvirus)的過程中，發(fā)現(xiàn)這兩種病毒的抗血清交互反應(yīng)，ELISA不能區(qū)分出這兩種不同的血清型。但應(yīng)用IC-RT-PCR

時(shí)，只要病毒濃度在10～100fg/mL之間，TMV或者ToMV

就能被檢測(cè)到，能擴(kuò)增出各自的分離物。2/5/2023

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70檢測(cè)病原物的種類Korimbocus

等報(bào)道，利用實(shí)時(shí)熒光PCR

檢測(cè)到侵染甘蔗的ScYLV(SugarcaneYellowleafvirus),其靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，

能從反轉(zhuǎn)錄PCR，ELISA等方法檢測(cè)不到ScYLV的樣本中檢測(cè)到該病毒。Murray等報(bào)道，多重免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄PCR能夠同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分出侵染香蕉的BBTV、BBrMV

、CMV等3種病毒。Bertolini

等報(bào)道了用多重反轉(zhuǎn)錄PCR

能同時(shí)檢測(cè)到侵染橄欖樹的CMV等6種RNA病毒。2/5/2023

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712.檢測(cè)病原物的數(shù)量目前，實(shí)時(shí)熒光PCR方法被評(píng)價(jià)為檢測(cè)土壤等樣品中微生物種類和數(shù)量的最有效方法。2/5/2023

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723.分析轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)楊立桃等（2005）利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

方法分析轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)，3個(gè)植株定量PCR分析的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)稍高于SouthernBlot

的分析結(jié)果。主要原因是SouthernBlot方法在同一個(gè)插入位點(diǎn)有多拷貝的T-DNA片段插入時(shí),轉(zhuǎn)基因植株的基因組在完全酶切時(shí)會(huì)產(chǎn)生相似的DNA片段,電泳分析時(shí)很難分辨清楚。定量PCR方法則完全避免了這種情況的發(fā)生,除非目的基因DNA片段在PCR引物處發(fā)生斷裂。兩種方法分析結(jié)果的比較顯示定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)更加有效、適用。2/5/2023

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73二.RAPD方法與

SCAR標(biāo)記（一）RAPD方法的基本原理（二）SCAR標(biāo)記（三）RAPD技術(shù)及SCAR標(biāo)記在植物病理學(xué)中的應(yīng)用2/5/2023

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74二.RAPD方法與SCAR標(biāo)記RAPD，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)是由美國杜邦公司的Williams(1990)和加利福尼亞生物研究所Welsh兩個(gè)小組在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法。此技術(shù)對(duì)基因組的DNA全部進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)多態(tài)性。由于整個(gè)基因組存在眾多反向重復(fù)序列，單一隨機(jī)引物與反向重復(fù)序列結(jié)合,使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。由于該方法可在缺乏任何分子生物學(xué)研究背景的物種上應(yīng)用（構(gòu)建基因組指紋圖譜、闡明物種親緣關(guān)系等），且研究費(fèi)用低廉，表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，獲得了廣泛應(yīng)用。由于PCR方法只能對(duì)已經(jīng)了解了基因序列的情況下才能使用，就極大的限制了其應(yīng)用范圍。為在缺乏任何分子生物學(xué)研究背景的物種上應(yīng)用（檢測(cè)、鑒定病原物、闡明物種親緣關(guān)系等），就產(chǎn)生了RAPD方法。2/5/2023

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75RAPD方法的缺點(diǎn)在RAPD方法獲得廣泛應(yīng)用的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了該方法的最重要的缺點(diǎn)—標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定性。N.F.Weeden等人的研究表明，RAPD標(biāo)記檢測(cè)誤差在5%～10%之間。Paran和Michelmore(1993)提出的SCAR標(biāo)記技術(shù)可以解決這一問題。2/5/2023

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76（一）RAPD方法的基本原理RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般8～10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。模板DNA經(jīng)92～94℃變性解鏈,在足夠低的溫度下(35～37℃,一般低于40℃)與單個(gè)隨機(jī)引物(一般為10個(gè)堿基)退火,如果互補(bǔ)的兩條DNA鏈上的2個(gè)退火位點(diǎn)足夠接近(約200～2000bp),通過延伸便可擴(kuò)增出DNA片段。整個(gè)基因組存在眾多反向重復(fù)序列，單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合,就會(huì)使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。如此30次PCR循環(huán)也將產(chǎn)生上百萬倍的擴(kuò)增產(chǎn)物。200～2000bp反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列2/5/2023

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77RAPD方法的基本原理對(duì)于特定引物，不同生物類群的基因組DNA退火位點(diǎn)總有不同,能否擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物的種類、長(zhǎng)度就有所不同?？捎秒娪緳z測(cè)使用特定引物時(shí)DNA能否擴(kuò)增及擴(kuò)增片斷的（種類）長(zhǎng)度的多態(tài)性圖譜。不同物種，產(chǎn)生的多態(tài)性不同。故，可用此方法檢測(cè)、鑒定病原物（擴(kuò)增產(chǎn)物完全一樣，則兩者為相同生物）

；研究不同病原物的親緣關(guān)系（擴(kuò)增產(chǎn)物越相似，親緣關(guān)系越近）。2/5/2023

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780.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系22/5/2023

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79通常采用30個(gè)以上的隨機(jī)引物擴(kuò)增來篩選出若干可有效擴(kuò)增的引物通常采用30個(gè)以上的隨機(jī)引物，進(jìn)行30次以上的擴(kuò)增,就可獲得一組目標(biāo)基因組DNA多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同一生物類群具有相似的遺傳背景，擴(kuò)增獲得的DNA多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也是相似的；對(duì)不同生物類群來說，獲得的DNA多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也不相同。通過對(duì)目標(biāo)基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增獲得的DNA多態(tài)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)方法處理后（如進(jìn)行聚類分析，以樹狀聚類圖方式表達(dá)等），則可以得到相應(yīng)的DNA遺傳、分類、進(jìn)化等更多信息。2/5/2023

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80RAPD分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程RAPD分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程包括:(1)模板DNA的提取純化；(2)用隨機(jī)引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增（不少于30個(gè)隨機(jī)引物）；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)；(4)用統(tǒng)計(jì)方法處理。2/5/2023

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81煙草野火病抗性基因的RAPD分析徐秀紅采用了423條隨機(jī)引物對(duì)抗病親本Ky14和感病親本SpeightG-140進(jìn)行RAPD分析，其中9條引物能在抗、感親本間穩(wěn)定擴(kuò)增出有差異的條帶。9條引物在抗、感親本間的擴(kuò)增差異見圖。

2/5/2023

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82煙草野火病抗性基因的RAPD分析將以上9條引物在抗、感基因池間進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果只有引物S52在抗、感基因池間顯示出多態(tài)性差異，6次重復(fù)擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定。S52產(chǎn)生的差異片斷約2000bp，記作標(biāo)記S522000。S52在抗、感基因池間的擴(kuò)增結(jié)果見圖。

初步推斷，該標(biāo)記與來自N.longiflora的煙草野火病抗性基因存在連鎖。一族群中所有基因的集合為基因池（genepool）抗病基因池：多個(gè)抗病品種DNA的混合物。感病基因池：多個(gè)感病品種DNA的混合物。2/5/2023

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831.30001.19750.89500.77760.70660.61790.82990.67950.573100.50.60.70.80.91.01.11.21.3QYE3GXE1BEEBE4ABHU根據(jù)RAPD分析繪制出的10個(gè)生物群體的聚類圖2/5/2023

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84（二）SCAR標(biāo)記為解決RAPD標(biāo)記的不穩(wěn)定性問題，

Paran和Michelmore(1993)

提出了序列特異性擴(kuò)增區(qū)技術(shù)（sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR）。與RAPD

標(biāo)記法相比，SCAR標(biāo)記PCR反應(yīng)條件嚴(yán)謹(jǐn)、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)，在應(yīng)用上具有快速、簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)，已成為多種分子標(biāo)記中的首選標(biāo)記。2/5/2023

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85SCAR標(biāo)記原理該技術(shù)是通過對(duì)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對(duì)新的引物特異地?cái)U(kuò)增原引物可擴(kuò)增的DNA片段。一對(duì)新的引物：分別在原RAPD引物的3’與5’端各延長(zhǎng)10～14個(gè)堿基。延長(zhǎng)后的每個(gè)引物為18～24個(gè)堿基。除將引物加以改變以外，還應(yīng)將PCR擴(kuò)增條件加以適當(dāng)調(diào)整：退火溫度為60～66℃、MgCl2

濃度常為1.5mmol/L?！?/5/2023

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86（三）RAPD技術(shù)及

SCAR標(biāo)記在植物病理學(xué)中的應(yīng)用1.鑒定病原物的種類2.研究某些病原菌類群間的親緣關(guān)系3.進(jìn)行抗病基因的標(biāo)記定位2/5/2023

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871.鑒定病原物的種類區(qū)別形態(tài)相似的病原物：

特定引物擴(kuò)增可在某病原物中獲得特定的DNA譜帶，而在另一病原物中無此帶出現(xiàn)，此特異片段就是一種鑒定標(biāo)記。于拴倉等（2005）利用RAPD技術(shù)篩選了4個(gè)引物，可以將番茄葉霉病菌生理3

個(gè)生理小種完全區(qū)分開來?？嫡裆龋?005）用210條隨機(jī)引物對(duì)中國小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)5個(gè)主要生理小種進(jìn)行了RAPD分析,獲得了條中29號(hào)小種專化的SCAR標(biāo)記。曹麗華等建立了小麥條銹菌條中31號(hào)小種SCAR檢測(cè)標(biāo)記。2/5/2023

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882.研究某些病原菌類群間的親緣關(guān)系利用30個(gè)以上隨機(jī)引物的（特定）擴(kuò)增條帶的有無（1，0），進(jìn)行聚類分析，研究不同病原物的親緣關(guān)系（擴(kuò)增產(chǎn)物越相似，親緣關(guān)系越近）。吳小芹等（2005）對(duì)來自日本、韓國、美國、加拿大和中國大陸6省及臺(tái)灣地區(qū)的松材線蟲和擬松材線蟲16個(gè)蟲株的基因組DNA進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果顯示,松材線蟲和擬松材線蟲明顯分為兩大類。

在松材線蟲群體中,又可分為3個(gè)亞組:

中國大陸蟲株與日本蟲株為一亞組,加拿大蟲株為一亞組,中國臺(tái)灣蟲株與美國蟲株為一亞組。

擬松材線蟲群體亦可分為兩亞組:

一為日本、中國臺(tái)灣和中國江蘇蟲株,

二為韓國和中國湖南蟲株。2/5/2023

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893.進(jìn)行抗病基因的標(biāo)記定位如利用多個(gè)抗病、感病品種進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，也可望找到抗病、感病品種有差異的擴(kuò)增帶，則抗病品種共有的帶上即存在抗病基因。張志永等(1998)對(duì)30個(gè)栽培大豆品種進(jìn)行了RAPD指紋圖譜分析。結(jié)果表明：較短的片段S—5600和S—05660是抗病品種的特征性條帶;而較長(zhǎng)片段S—51000和S—51600是感病品種的特征性條帶。2/5/2023

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90三.RFLP和AFLP技術(shù)（一）RFLP的基本原理（二）AFLP的基本原理2/5/2023

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91三.RFLP和AFLP技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）是Bostein和White等人于1980年首次提出的分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP技術(shù)的優(yōu)越性在于穩(wěn)定性好、可靠。但此法費(fèi)用高，周期長(zhǎng)，多態(tài)性水平低，限制了這種技術(shù)的應(yīng)用。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）是由荷蘭科學(xué)家M.Zabeau和P.Vos于1993年提出的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的高效性，它無需基因組DNA的背景資料即可完成模板DNA多態(tài)性的檢測(cè)，可產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記,被認(rèn)為是一種高效的分子標(biāo)記技術(shù)。2/5/2023

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92（一）RFLP的基本原理生物不同類群的DNA序列中，總會(huì)存在許多不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。因而，當(dāng)某一特定的限制性酶切割DNA時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生酶切DNA片段長(zhǎng)度的差異。這種差異可反映在電泳圖譜上。檢測(cè)出的特異帶型是鑒別物種、分析類群間類緣關(guān)系等的科學(xué)依據(jù)。對(duì)于每一個(gè)DNA基因組/限制性內(nèi)切酶組合來說，所產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度多態(tài)性是特異性的，故RFLP被稱為DNA指紋。2/5/2023

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93DNA提取→用DNA限制性內(nèi)切酶消化

→凝膠電泳分離限制性片段

→將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上

→用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱Southern雜交）

→放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)顯示出不同材料對(duì)該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。

RFLP的基本步驟用限制性酶來酶解高等生物核DNA會(huì)產(chǎn)生數(shù)萬個(gè)片段，其大小變化是連續(xù)的，如進(jìn)行電泳分離，只能看到彌散狀的連成一片的電泳結(jié)果。然而，各限制片段在凝膠中還是分開的，但不能分辨。進(jìn)行Southern印跡轉(zhuǎn)移操作，用特定的探針與濾膜上的DNA雜交，經(jīng)過放射自顯影就能檢測(cè)到高等生物核DNA的RFLP。2/5/2023

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94酶切，電泳后（轉(zhuǎn)膜雜交自顯影）檢測(cè)結(jié)果較大片段RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本手段就是通過電泳的方法分離這些片段。轉(zhuǎn)膜、雜交、自顯影后檢測(cè)結(jié)果較小片段2/5/2023

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95（二）

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