實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)細(xì)胞的制備

《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備原理。2、學(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法和技術(shù)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理

1、感受態(tài)細(xì)胞制備原理：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法、CaCl2、RbCl等化學(xué)試劑法)處理后，細(xì)菌會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。（Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域）分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2、感受態(tài)轉(zhuǎn)化原理：細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，同時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA會(huì)形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過42℃短時(shí)間的熱激處理，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)離心設(shè)備臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)制冰機(jī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：E.

coliJM109。2、實(shí)驗(yàn)試劑：LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加雙蒸水至總體積1L，高壓下蒸氣滅菌。(2)0.1mol/LCaCl2溶液：稱取1.1098gCaCl2(無水,分析純)，溶于90mL重蒸水中，定容至100mL，高壓滅菌。(3)30%甘油：量取30mL甘油，加入70mL雙蒸水，混勻，定容至100mL，高壓滅菌。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟菌體的培養(yǎng)(事先已做)受體菌的培養(yǎng)從

LB平板上挑取新活化的E.coli

JM109單菌落，接種于3～5

mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)

12hr左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以

1:

100～1:

50

的比例接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3hr，至OD600為0.3～0.4。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)取2個(gè)1.5mL離心管，分別轉(zhuǎn)入1mL菌液，4℃12000rpm，離心2min。棄去上清，每管加入1mL預(yù)冷的

0.1mol/L

CaCl2

溶液，懸浮細(xì)胞，冰上放置

30min。4℃

，12000rpm，離心2min。棄去上清，每管加入50μL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2

溶液，輕緩懸浮細(xì)胞,50μL預(yù)冷的30%甘油，冰上放置5min，即為感受態(tài)細(xì)胞懸液。將感受態(tài)細(xì)胞懸液，放置于-80℃，可保存半年。2.感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2

法，超凈臺(tái)內(nèi))分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第二天，CaCl2

法前一天晚上，第二天早上菌體的活化感受態(tài)的制備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)每人2管感受態(tài)細(xì)胞結(jié)果分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600來控制。JM109菌株的OD600為0.3－0.4密度比較合適，密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心，懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔