湖南大學(xué)博士學(xué)位答辯PPT

鼠李糖脂的菌體吸附及其對(duì)菌體表面的改性作用研究

匯報(bào)人

指導(dǎo)老師背景和目的疏水性有機(jī)物污染的土壤的原位修復(fù)中，外源微生物在土壤介質(zhì)中的高效傳輸及在有機(jī)污染物上的富集可以提高修復(fù)效率在土壤修復(fù)過(guò)程中，生物表面活性劑增溶污染物的同時(shí)，有可能與微生物菌體發(fā)生作用，改變菌體的表面性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)上述功能本論文作為上述目的的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，考察了生物表面活性劑鼠李糖脂在微生物菌體上的吸附規(guī)律以及由吸附所引起的菌體表面親水疏水性的變化規(guī)律鼠李糖脂的產(chǎn)生、提純和表征方法產(chǎn)生：產(chǎn)生菌為PseudomonasaeruginosaCCTCCAB93066，以20g/L的葡萄糖為碳源，在MSM溶液中，于30℃、200rpm條件下，發(fā)酵培養(yǎng)72h，獲得最大產(chǎn)劑量。分離和提純：首先通過(guò)離心將菌體從發(fā)酵液中分離，再采用酸沉降法將鼠李糖脂粗產(chǎn)品從發(fā)酵液中分離出來(lái)，將粗產(chǎn)品冷凍干燥并溶于氯仿后，過(guò)濾除去不溶性雜質(zhì)，濾液通過(guò)硅膠柱層析除去其它雜質(zhì)，并將單糖脂和二糖脂分離。二糖脂經(jīng)過(guò)兩次柱層析實(shí)現(xiàn)完全純化。表征：采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)提純的鼠李糖脂單糖脂和二糖脂及其2-溴代苯乙酮的衍生物進(jìn)行化學(xué)成分表征。結(jié)果與討論鼠李糖脂單糖脂混合物外觀上呈棕色粘稠油狀；鼠李糖脂二糖脂混合物呈黃色膏狀或白色微黃的晶體狀。各部分鼠李糖脂的HPLC-MS圖譜如下。aRhaC10C10RhaC10C12-H2RhaC10C12bcdm/z鼠李糖脂單糖脂HPLC-MS圖譜。a)HPLC圖譜；b)12.5-13minm/z1006.9[(RhaC10C10)2-H]-；c)14-14.5minm/z529.1[RhaC10C12-H2-H]-；d)15-15.5minm/z531.1[RhaC10C12-H]-abcdm/z鼠李糖脂單糖脂的2-溴代苯乙酮衍生物的HPLC-MS圖譜。a)HPLC色譜圖；b)14.5-15.0minm/z640.1[RhaC10C10苯甲酰甲脂+NH4+]；c)15.5-16.0minm/z665.9[RhaC10C12-H2苯甲酰甲脂+NH4+]；d)16.5-17.0minm/z668.0[RhaC10C12苯甲酰甲脂+NH4+]bcdaacbdm/z一次柱層析得到的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS圖譜。a)HPLC圖譜；b)10.5-11minm/z649.1[Rha2C10C10-H]-；c)12-12.5minm/z675.0[Rha2C10C12-H2-H]-；d)12.5-13minm/z503.0[RhaC10C10-H]-；e)13-13.5minm/z677.1[Rha2C10C12-H]-aRha2C10C10Rha2C10C12-H2RhaC10C10Rha2C10C12bcdeabcdem/z一次柱層析得到的鼠李糖脂二糖脂的2-溴代苯乙酮衍生物的HPLC-MS圖譜。a)HPLC色譜圖；b)13-13.5minm/z786.1[Rha2C10C10苯甲酰甲脂+NH4+]；c)14-14.5minm/z812.2[Rha2C10C12-H2苯甲酰甲脂+NH4+]；d)14.5-15minm/z723.9[RhaC10C10苯甲酰甲脂+(CH3CH2)3NH+]或640.0[RhaC10C10苯甲酰甲脂+NH4+]；e)15-15.5minm/z814.2[Rha2C10C12苯甲酰甲脂+NH4+]bcdeaabdcem/z二次柱層析提純的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS圖譜。a)HPLC圖譜；b)7.0-8.0minm/z621.1[Rha2C10C8-H]-；c)9.5-10.0minm/z647.1[RhaC10C10-H2-H]-；d)10.5-11.0minm/z649.0[Rha2C10C10-H]-；e)12.0-12.5minm/z675.0[Rha2C10C12-H2-H]-；f)13.0-13.5minm/z677.0[Rha2C10C12-H]-aRha2C10C10Rha2C10C12-H2Rha2C10C12bcdRha2C10C8Rha2C10C10-H2efabcdef小結(jié)采用銅綠假單胞菌CCTCCAB93066發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生了生物表面活性劑鼠李糖脂，并采用酸沉降和柱層析的方法分離和純化了得到的鼠李糖脂，獲得了較純的鼠李糖脂單糖脂和二糖脂。通過(guò)HPLC-MS對(duì)它們的成分進(jìn)行了鑒定，它們的主要成分均為Rha(2)C10C10、Rha(2)C10C12-H2和Rha(2)C10C12。本結(jié)果為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。低濃度鼠李糖脂在近中性溶液中的聚集行為背景abc生物表面活性劑具有表面活性劑的一般性質(zhì)，能夠在溶液中于不同條件下形成不同形態(tài)的聚集體，如圖中所示的膠束(a)、膠囊(b)和雙層膜結(jié)構(gòu)(c)。鼠李糖脂自身形成的聚集體可能影響到它在菌體上的吸附特征。另外鑒于本論文研究的應(yīng)用背景，有必要考察鼠李糖脂在近中性溶液中的聚集行為。MonorhamnolipidDirhamnolipidTotalRhaC10C10RhaC10C12-H2RhaC10C12TotalRha2C10C10Rha2C10C12-H2Rha2C10C12molecularweight510a504530532658a650676678Approximatemolefractioninmixture0.800.080.120.700.110.19MSmajorions(M-H)1007b529531649675677molecularweightofderivative(M-phenacylesterc)622648650768794796MSmajorionsofderivative(M-phenacylester+NH4+)640666668786812814aAveragemolecularweight.bMolecularweightofRhaC10C10

dimer-H.cCondensateofarhamnolipidmoleculeandaBr-CH2-(C=O)-C6H5byremovalofHBr(molecularweightofphenacyl=119).所用鼠李糖脂為完全提純的鼠李糖脂單糖脂和二糖脂，各包含三種主要成分材料和方法鼠李糖脂CMC測(cè)定：通過(guò)溶液表面張力與鼠李糖脂濃度之間的關(guān)系曲線得到單糖脂和二糖脂在MSM中的CMC。聚集體的粒徑和表面zeta電位：鼠李糖脂單糖脂和二糖脂溶于MSM溶液中，在不同濃度和不同pH條件下，測(cè)定聚集物的粒徑分布和表面zeta電位，考察兩者隨濃度和溶液pH的變化規(guī)律。鼠李糖脂單糖脂和二糖脂的臨界膠束濃度CMC分別為75μM和106μM單糖脂在MSM中的聚集體共有三種形態(tài)，即使在鼠李糖脂濃度低于CMC（75μM）時(shí)也檢測(cè)到了聚集體的存在。對(duì)于同一pH下，隨著濃度的增加，一般地有大粒子c和中等粒子b的體積含量減小，而小粒子a的體積含量增加。一般地，隨pH的增加聚集體有也向小粒子轉(zhuǎn)化的規(guī)律。

鼠李糖脂二糖脂在MSM中也形成三種形態(tài)的聚集體，同樣即使在鼠李糖脂濃度低于CMC（75μM）時(shí)也檢測(cè)到了聚集體的存在。在所有pH下，隨著鼠李糖脂濃度的增加，三種粒子的粒徑均有變小的一般規(guī)律。各濃度下，大粒子b的體積含量基本隨pH的增加而降低，小粒子a的體積含量在各pH下均為主要，且隨pH的增大而增加隨著液相中二糖脂濃度的升高，聚集體表面zeta電位先升高后降低，最后趨于穩(wěn)定。MSM溶液的pH的升高也使聚集體表面zeta電位降低（●）pH6.0；（●）pH6.5；（▼）pH7.0；（▼）pH7.5；（■）pH8.0

小結(jié)單糖脂的CMC比二糖脂要小，認(rèn)為是單糖脂分子較大的疏水/親水比所致。在濃度低于和高于CMC時(shí)，單糖脂和二糖脂均能形成聚集體，但兩種聚集體結(jié)構(gòu)上可能存在差別。隨著濃度和pH的增加，聚集體的粒徑均有由大變小的一般規(guī)律，且小粒徑聚集體的含量增加，推測(cè)為聚集體結(jié)構(gòu)變化和表面分子電性變化共同作用的結(jié)果，而對(duì)于聚集體表面zeta電位的研究結(jié)果也有力支持該推測(cè)。聚集體有可能作為整體參與到鼠李糖脂與微生物體的相互作用過(guò)程中，因此在研究鼠李糖脂在微生物體上的吸附時(shí)，它需要加以考慮。五種表面活性劑在銅綠菌體上的吸附及其對(duì)菌體表面親水疏水性的影響背景表面活性劑在微生物菌體上的吸附過(guò)程是表面活性劑化學(xué)基團(tuán)和菌體表面化學(xué)基團(tuán)相互作用的過(guò)程，表面活性劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)吸附特征及菌體表面性質(zhì)的改變有影響材料和方法吸附質(zhì)為CTAB、TritonX-100、Tween80、SDS以及一次純化后的鼠李糖脂二糖脂混合物。吸附劑為銅綠假單胞菌CCTCCAB93066菌體。菌體的表面親水疏水性通過(guò)菌體在親水性和疏水性玻璃珠表面的吸附率表征不同濃度表面活性劑溶液對(duì)數(shù)期菌體鼠李糖脂的吸附量、吸附前后菌體表面親水疏水性的變化a)吸附速率曲線；b)一次速率方程回歸曲線；c)二次速率方程回歸曲線。CTAB（●）、TritonX-100（◆）、Tween80（）、SDS（）和鼠李糖脂（■）結(jié)果和討論一次速率方程：二次速率方程：

二次速率方程擬合得更好，根據(jù)吸附速率常數(shù)可以得到，表面活性劑的吸附速率從大到小依次為：CTAB、TritonX-100、Tween80、鼠李糖脂和SDSFreundlich等溫吸附方程：或：

這幾種表面活性劑在該銅綠菌體表面上的吸附符合Freundlich規(guī)律。CTAB和鼠李糖脂對(duì)應(yīng)的K值較大，說(shuō)明細(xì)胞表面和這兩種表面活性劑之間的吸附驅(qū)動(dòng)力較大；細(xì)胞吸附TritonX-100的能力最弱a)等溫吸附曲線；b)Freundlich模型回歸曲線。CTAB（●）、TritonX-100（◆）、Tween80（）、SDS（）和鼠李糖脂（■）表面活性劑吸附率α(%)親水性表面疏水性表面02.5mg/l25mg/l250mg/l02.5mg/l25mg/l250mg/lCTAB25.5±0.013.7±0.118.1±0.211.6±0.114.5±0.115.9±0.123.4±0.125.8±0.2TritonX-10015.6±0.514.8±0.318.7±0.516.5±0.216.5±0.027.3±0.3Tween8014.1±0.111.7±0.116.2±0.021.8±0.020.9±0.124.2±0.0SDS10.2±0.15.4±0.019.2±0.016.8±0.110.2±0.119.2±0.0鼠李糖脂16.8±0.112.7±0.111.9±0.116.8±0.118.6±0.017.0±0.0用表面活性劑吸附處理過(guò)的銅綠假單胞菌在親水和疏水性玻璃珠上的吸附。CTAB、TritonX-100和Tween80的吸附提高了細(xì)胞在疏水性，并減小了菌體在親水性。鼠李糖脂和SDS的吸附減弱了菌體表面的親水性。a)CTAB；b)TritonX-100；c)Tween80；d)SDS；e)鼠李糖脂。符號(hào)：30°C，IS=0（●）、30°C，IS=20mM（◆）、30°C；IS=200mM（）、40°C，IS=0（■）。隨著溫度的增加，TritonX-100、Tween80和鼠李糖脂的吸附量都稍有減小，SDS的吸附量有了顯著的增加；隨離子強(qiáng)度的增大，TritonX-100，Tween80和鼠李糖脂的吸附量增大，而SDS的吸附量有顯著增加，當(dāng)離子強(qiáng)度為200mM時(shí)，SDS的吸附率幾乎達(dá)到100%，和CTAB的吸附率相當(dāng)。小結(jié)五種表面活性劑在銅綠假單胞菌CCTCCAB93066菌體上的吸附動(dòng)力學(xué)規(guī)律與二級(jí)速率模型符合較好，而它們的等溫吸附規(guī)律則與Freundlich方程符合較好。由于這幾種表面活性劑的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上的差異，吸附驅(qū)動(dòng)力的類型和強(qiáng)弱有明顯差別。在靜電引力驅(qū)動(dòng)下，CTAB吸附非常快，且吸附率接近100%。鼠李糖脂的吸附量大，可能是鼠李糖脂分子結(jié)構(gòu)與菌體表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性引起。SDS達(dá)到平衡所用的時(shí)間最長(zhǎng)，推測(cè)為靜電斥力導(dǎo)致。兩種非離子表面活性劑，達(dá)到吸附平衡較快，但吸附率較低，這與它們較大的極性基團(tuán)有關(guān)。五種表面活性劑的吸附對(duì)菌體表面的親水性均有減弱作用，同時(shí)CTAB、TritonX-100和Tween80增強(qiáng)了菌體表面的疏水性。鼠李糖脂在四種菌體上的吸附及其對(duì)菌體表面性質(zhì)的影響背景有研究表明，生物表面活性劑對(duì)菌體表面性質(zhì)的改變與菌體性質(zhì)有密切關(guān)系。因此，為了更好的控制和利用生物表面活性劑調(diào)節(jié)菌體表面性質(zhì)這一功能，需要深入了解生物表面活性劑與不同菌體相互作用而改變其表面性質(zhì)的機(jī)制。本章以上一章節(jié)研究結(jié)果為基礎(chǔ)，從微生物的一般性入手，繼續(xù)研究了鼠李糖脂二糖脂在四種微生物菌體表面的吸附行為以及吸附與菌體表面性質(zhì)的關(guān)聯(lián)。材料和方法吸附質(zhì)為一次純化后的鼠李糖脂二糖脂混合物。吸附劑菌種為一株銅綠假單胞菌，兩株枯草芽孢桿菌和一株解脂假絲酵母，它們分別作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和酵母的代表菌。首先考察了它們菌體的表面性質(zhì)隨生長(zhǎng)時(shí)間的變化，接著考察了它們對(duì)數(shù)期菌體和靜止期菌體對(duì)鼠李糖脂的吸附特征以及菌體表面親水疏水性的變化。菌體的表面親水疏水性通過(guò)菌體在正十六烷相中的吸附率（BATH測(cè)試）表征結(jié)果與討論在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，四種菌體均不產(chǎn)生生物表面活性劑。從對(duì)數(shù)期中后期到靜止期的過(guò)程中，三種細(xì)菌的表面變得更加親水，而解脂假絲酵母CCTCCAB92044的表面變得疏水，四種菌的表面zeta電位變化不大銅綠假單胞菌

CCTCCAB93072a)總鼠李糖脂在對(duì)數(shù)期細(xì)胞（●）和靜止期細(xì)胞（○）表面的平衡吸附曲線；b)鼠李糖脂各成分在對(duì)數(shù)期菌體表面的平衡吸附曲線，RhaC10C10（◆），Rha2C10C10（●），Rha2C10C12-H2（□）和Rha2C10C12（▲）；c)鼠李糖脂各成分在靜止期菌體表面的平衡吸附曲線，符號(hào)含義同b)；d)對(duì)數(shù)期菌體（●）和靜止期菌體（○）在不同濃度鼠李糖脂吸附處理后的BATH吸附率；e)對(duì)數(shù)期菌體（■）和靜止期菌體（□）在不同濃度鼠李糖脂吸附處理后的表面zeta電勢(shì)。在以兩種菌體為吸附劑時(shí)，均發(fā)生了鼠李糖脂的兩步吸附現(xiàn)象，并且對(duì)數(shù)期菌體在這兩步吸附過(guò)程中均在較低的平衡濃度下達(dá)到吸附飽和（圖a）。對(duì)數(shù)期菌體有更強(qiáng)的吸附鼠李糖脂分子的能力。對(duì)于鼠李糖脂的各成分，它們的平衡吸附曲線的形狀和總表面活性劑平衡吸附曲線的形狀類似（圖b和圖c），然而對(duì)數(shù)期細(xì)胞對(duì)RhaC10C10的平衡吸附曲線中沒(méi)有第一個(gè)吸附平臺(tái)，表明該成分在該平衡濃度范圍內(nèi)的吸附受二糖脂成分的吸附影響較小。吸附使兩種菌體表面親水疏水性向相反方向變化，且變化均在低鼠李糖脂濃度時(shí)最為顯著，表明菌體的表面親水疏水性對(duì)低濃度的鼠李糖脂的吸附更為敏感（圖d）。菌體表面電性對(duì)鼠李糖脂的吸附均不敏感（圖e）枯草芽孢桿菌

CCTCCAB93108對(duì)數(shù)期菌體平衡吸附曲線包括在低濃度和高濃度時(shí)吸附量隨平衡濃度的增加部分和中間的吸附平臺(tái)。靜止期菌體的平衡吸附曲線包括低平衡濃度時(shí)的吸附平臺(tái)和高平衡濃度時(shí)吸附量隨平衡濃度增加而上升部分（圖a）。和銅綠假單胞菌CCTCCAB93072一樣，該菌對(duì)數(shù)期菌體的吸附能力高于靜止期菌體。鼠李糖脂各成分在對(duì)數(shù)期菌體上的平衡吸附曲線形狀與總表面活性劑類似，不同的是RhaC10C10的吸附平臺(tái)不明顯，表明該單糖脂的吸附受二糖脂成分吸附的影響也較?。▓Db）。但各成分在靜止期菌體上的吸附有很大差別。Rha2C10C10的吸附量是平衡濃度的凸函數(shù)，而具有更長(zhǎng)的脂肪烴鏈的Rha2C10C12和Rha2C10C12-H2兩種成分為凹函數(shù)（圖c），表明在吸附競(jìng)爭(zhēng)中，二糖脂三種成分中的強(qiáng)者由強(qiáng)疏水性的成分向相對(duì)弱疏水性成分的轉(zhuǎn)變。菌體對(duì)低濃度的鼠李糖脂的吸附敏感，對(duì)數(shù)期菌體BATH吸附率隨鼠李糖脂濃度的升高迅速降低，而靜止期菌體的表面親水疏水性在整個(gè)測(cè)試的鼠李糖脂濃度范圍內(nèi)經(jīng)歷的急劇的上升和下降（圖d）。表面zeta電勢(shì)對(duì)鼠李糖脂的吸附不敏感（圖e）枯草芽孢桿菌

N1對(duì)數(shù)期細(xì)胞的平衡吸附曲線包括低平衡濃度時(shí)的吸附平臺(tái)和高平衡濃度時(shí)吸附量隨平衡濃度的上升部分，靜止期菌體的平衡吸附曲線包括低平衡濃度和高平衡濃度時(shí)吸附量上升部分和中間的吸附平臺(tái)等三部分（圖a）。靜止期細(xì)胞對(duì)鼠李糖脂的吸附能力強(qiáng)于對(duì)數(shù)期細(xì)胞。對(duì)各成分來(lái)說(shuō)，Rha2C10C12和Rha2C10C12-H2在對(duì)數(shù)期細(xì)胞上的吸附量隨平衡濃度的增加而穩(wěn)定上升，但對(duì)于其它脂肪烴鏈更短的RhaC10C10和Rha2C10C10成分，在中間平衡濃度范圍時(shí)，吸附量是平衡濃度的凸函數(shù)（圖b），表明疏水性吸附在該平衡濃度范圍內(nèi)作用明顯。四種成分在靜止期細(xì)胞表面的吸附和總表面活性劑的平衡吸附規(guī)律一樣（圖c）。在濃度低于50μM的鼠李糖脂吸附處理下，對(duì)數(shù)期菌體疏水性隨鼠李糖脂濃度升高而降低，但當(dāng)鼠李糖脂濃度更高時(shí)，菌體BATH吸附率緩慢降低。對(duì)于靜止期菌體，當(dāng)鼠李糖脂濃度由250μM升至500μM時(shí)，其表面疏水性顯著增加，但濃度高于500μM后其表面疏水性降低（圖d）。該菌對(duì)數(shù)期和靜止期菌體表面的zeta電勢(shì)對(duì)鼠李糖脂的吸附不敏感（圖e）。解脂假絲酵母

CCTCCAB92044對(duì)數(shù)期菌體吸附平衡曲線包括兩端吸附平臺(tái)以及曲線中間吸附量隨平衡濃度的急劇增長(zhǎng)部分，靜止期菌體包括吸附量隨平衡濃度而緩慢增加部分、吸附平臺(tái)和吸附量隨平衡濃度顯著增加部分（圖a）。該菌的對(duì)數(shù)期菌體也能夠在測(cè)試濃度范圍內(nèi)使平衡吸附曲線達(dá)到第二個(gè)吸附平臺(tái)，與銅綠假單胞菌CCTCCAB93072的對(duì)數(shù)期菌體相比較，該吸附平臺(tái)在更低的平衡濃度下達(dá)到。對(duì)于各成分來(lái)說(shuō)，RhaC10C10在對(duì)數(shù)期菌體上的吸附量在低平衡濃度時(shí)是它的凹函數(shù)，而對(duì)于其它三種二糖脂成分均為吸附平臺(tái)（圖b），再次證明了鼠李糖脂單糖脂吸附相對(duì)于二糖脂的獨(dú)立性。對(duì)于靜止期菌體，RhaC10C10和Rha2C10C10等短脂肪鏈成分的吸附量相對(duì)較高，尤其是鼠李糖脂平衡濃度比較高的時(shí)候（圖c）。在低濃度鼠李糖脂溶液的處理下，對(duì)數(shù)期細(xì)胞的BATH吸附率由25%迅速增至40%，但濃度進(jìn)一步升高對(duì)菌體表面疏水性影響不明顯或使之降低。靜止期細(xì)胞的表面疏水性比對(duì)數(shù)期菌體高許多，BATH吸附率保持在50%左右，表明鼠李糖脂的吸附對(duì)菌體表面疏水性的影響不明顯（圖d）。菌體表面的zeta電勢(shì)在整個(gè)濃度范圍內(nèi)受鼠李糖脂吸附影響不明顯（圖e）。極性吸附非極性吸附鼠李糖脂在微生物體表面的吸附改變菌體表面性質(zhì)的基本模式表面疏水性增強(qiáng)表面親水性增強(qiáng)小結(jié)鼠李糖脂二糖脂混合物在微生物菌體上的吸附特征依賴于菌體的種類及其生理狀態(tài)；而對(duì)于吸附質(zhì)，具有不同分子結(jié)構(gòu)的成分表現(xiàn)出了不同的吸附行為，同時(shí)膠團(tuán)的形成對(duì)吸附行為也有顯著影響。鼠李糖脂的吸附導(dǎo)致了菌體表面親水疏水性的變化，而低液相濃度下表面活性劑的單分子吸附比膠束吸附的作用更強(qiáng)。單糖脂和二糖脂在兩株銅綠假單胞菌表面的吸附及其對(duì)菌體表面性質(zhì)的影響背景前面的研究表明不同性質(zhì)的表面活性劑在銅綠菌體表面的吸附表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，對(duì)菌體表面性質(zhì)的影響也有差異；微生物的種類和生長(zhǎng)狀態(tài)（吸附劑的性質(zhì)）決定了菌體的表面性質(zhì)，同時(shí)對(duì)吸附有較大的影響，而吸附也使得菌體的表面性質(zhì)呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化。通過(guò)考察不同分子結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂（單糖脂和二糖脂）的吸附差異以及相同菌種不同菌株對(duì)鼠李糖脂吸附性質(zhì)的的差別有可能幫助更深入地了解吸附特征和機(jī)理。材料和方法實(shí)驗(yàn)用鼠李糖脂為純化的鼠李糖脂單糖脂和二次純化的鼠李糖脂二糖脂。吸附劑為銅綠假單胞菌CCTCCAB93066和銅綠假單胞菌CCTCCAB93072以葡萄糖或正十六烷為碳源生長(zhǎng)得到的菌體，其中銅綠假單胞菌CCTCCAB93066為鼠李糖脂的產(chǎn)生菌。測(cè)定了單糖脂和二糖脂的平衡吸附曲線以及菌體表面的親水疏水性。菌體表面的親水疏水性同樣通過(guò)菌體在正十六烷相中的吸附率（BATH測(cè)試）表征。兩種鼠李糖脂在以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)的PseudomonasaeruginosaCCTCCAB93066菌體上的吸附。鼠李糖脂單糖脂的吸附強(qiáng)于二糖脂的吸附，另外在高濃度二糖脂環(huán)境中菌體額外釋放了二糖脂。低濃度的鼠李糖脂的吸附增強(qiáng)了菌體表面的疏水性結(jié)果與討論兩種鼠李糖脂在以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)的PseudomonasaeruginosaCCTCCAB93072菌體上的吸附。鼠李糖脂單糖脂的吸附強(qiáng)于二糖脂的吸附，二糖脂呈現(xiàn)多級(jí)吸附，并沒(méi)有像PseudomonasaeruginosaCCTCCAB93066菌體一樣釋放二糖脂。低濃度的鼠李糖脂的吸附增強(qiáng)了菌體表面的疏水性，且二糖脂效果明顯兩種鼠李糖脂在以十六烷為碳源生長(zhǎng)的PseudomonasaeruginosaCCTCCAB93066菌體上的吸附。鼠李糖脂單糖脂的吸附強(qiáng)于二糖脂的吸附，另外在高濃度二糖脂環(huán)境中菌體也額外釋放了二糖脂。低濃度的鼠李糖脂的吸附增強(qiáng)了菌體表面的疏水性，二糖脂的效果同樣要更為顯著小結(jié)鼠李糖脂吸附質(zhì)和兩株銅綠假單胞菌菌體吸附劑的固有性質(zhì)，如鼠李糖脂的分子結(jié)構(gòu)、菌體表面組成及細(xì)胞生理等，決定了吸附性質(zhì)。這些性質(zhì)導(dǎo)致了鼠李糖脂單糖脂和二糖脂完全不同的吸附行為，以及單糖脂或二糖脂在不同株銅綠假單胞菌體吸附特征的差異。由于鼠李糖脂的吸附，菌體CSH發(fā)生了由高度親水向疏水的轉(zhuǎn)變，變化程度同時(shí)決定于鼠李糖脂和細(xì)胞的類型。鼠李糖脂在銅綠假單胞菌表面的吸附對(duì)它以不同碳源為底物的生長(zhǎng)的影響背景微生物菌體吸附了鼠李糖脂之后會(huì)發(fā)生表面親水疏水性的變化，這種變化對(duì)菌體攝取親水性或疏水性碳源的過(guò)程將會(huì)有何種影響？是否會(huì)改變微生物菌體對(duì)不同碳源的攝取模式？吸附對(duì)微生物菌體的毒性如何？在鼠李糖脂的這方面應(yīng)用中，這是需要解決的實(shí)際問(wèn)題。材料和方法實(shí)驗(yàn)用鼠李糖脂為純化的鼠李糖脂單糖脂和二次純化的鼠李糖脂二糖脂。實(shí)驗(yàn)降解菌為銅綠假單胞菌CCTCCAB93066，它同時(shí)為鼠李糖脂的產(chǎn)生菌。探討了鼠李糖脂對(duì)正十六烷的增溶作用，考察了吸附處理后的菌體降解葡萄糖、膠團(tuán)化的正十六烷以及單獨(dú)相正十六烷的影響。另外通過(guò)電鏡掃描考察了菌體與正十六烷膠團(tuán)的相互作用。鼠李糖脂溶液過(guò)量正十六烷搖床振蕩培養(yǎng)液相分離萃取十六烷GC定量鼠李糖脂單糖脂和二糖脂對(duì)正十六烷的增溶性不同濃度鼠李糖脂溶液對(duì)數(shù)期菌體吸附鼠李糖脂的吸附量、吸附前后菌體表面親水疏水性的變化離心后菌體配菌液葡萄糖培養(yǎng)基膠束十六烷培養(yǎng)基兩相十六烷培養(yǎng)劑葡萄糖含量；菌體蛋白質(zhì)含量；降解完成后菌體表面性質(zhì)葡萄糖含量；菌體蛋白質(zhì)含量；鼠李糖脂含量；菌體表面性質(zhì)菌體蛋白質(zhì)含量；降解完成后菌體表面性質(zhì)×3×3×3×3×3×3×3×3×3鼠李糖脂單糖脂的吸附對(duì)銅綠菌體降解不同形式的碳源的影響鼠李糖脂單糖脂和二糖脂對(duì)十六烷的增溶能力不同。在低濃度時(shí)單糖脂更強(qiáng)，而高濃度時(shí)二糖脂的能力強(qiáng)?？赡芘c它們的聚集形態(tài)有關(guān)。更大的親水基更大的增溶空間結(jié)果和討論鼠李糖脂單糖脂十六烷的增溶能力與溶液體系的pH有關(guān)，與其它文獻(xiàn)中報(bào)道的十八烷的增溶類似，在pH接近中性的時(shí)候增溶能力最強(qiáng)。葡萄糖未發(fā)生明顯的菌體吸附；高濃度單鼠李糖脂的吸附對(duì)菌體降解葡萄糖的速率影響不大，但后期減弱了蛋白質(zhì)的消耗；低濃度單鼠李糖脂的吸附使停滯期增長(zhǎng)，說(shuō)明對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用鼠李糖脂和十六烷含量在前15分鐘內(nèi)急劇下降，反映了十六烷膠團(tuán)的吸附；但吸附的膠團(tuán)化十六烷不能被降解，后期反而被釋放高濃度單鼠李糖脂的吸附增強(qiáng)了銅綠菌體以單獨(dú)相十六烷為碳源的生長(zhǎng)，而低濃度單鼠李糖脂的吸附對(duì)菌體的生長(zhǎng)有抑制作用單鼠李糖脂的吸附增強(qiáng)了菌體表面的親水性，其中低濃度單鼠李糖脂的吸附效果更為明顯。以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)后菌體表面變得極為親水，以膠團(tuán)化的正十六烷和單獨(dú)相的正十六烷生長(zhǎng)后菌體均變得疏水。鼠李糖脂濃度BATH吸附率（%）吸附前吸附后降解后葡萄糖膠團(tuán)化正十六烷單獨(dú)相正十六烷039.5±5.7a30.0±4.15.1±3.331.8±3.446.8±10.175μM9.0±1.32.4±3.144.0±0.631.5±3.7750μM23.6±4.85.4±1.941.6±5.441.3±6.3a

三次平行測(cè)樣的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差abMLSSMMSScdPVaVbgef菌體吸附正十六烷膠團(tuán)前后的電鏡掃描照片。a)和b)空白菌體；c)~g)菌體對(duì)膠團(tuán)的吸附。L，大型正十六烷膠團(tuán)；M，中型正十六烷膠團(tuán)；S，小型正十六烷膠團(tuán)；Va，吸附的正十六烷膠團(tuán)；Vb，脫落的正十六烷膠團(tuán)；P，脫落的膠團(tuán)留下的印跡。照片中可以明顯看到各種粒徑的正十六烷膠團(tuán)與菌體之間的相互作用。直接攝取溶解態(tài)正十六烷攝取膠團(tuán)化正十六烷吸附于有機(jī)相攝取正十六烷實(shí)驗(yàn)條件下，第一種模式不顯著，原因可能是溶解態(tài)正十六烷濃度低于生長(zhǎng)閾值；第二種模式中，發(fā)生了正十六烷膠團(tuán)的吸附，但攝取步驟并沒(méi)有因?yàn)槲降玫皆鰪?qiáng)。第三種模式可能為增強(qiáng)降解的主要方式小結(jié)單糖脂在濃度低于CMC時(shí)增溶效率比高于CMC要高，這可能與兩種濃度下形成的膠團(tuán)形式有關(guān)，而二糖脂在整個(gè)濃度范圍內(nèi)對(duì)正十六烷的增溶量與鼠李糖脂濃度呈線性關(guān)系，反映了因鼠李糖脂結(jié)構(gòu)不同而引起的增溶規(guī)律的差異。不同濃度單糖脂吸附處理的菌體對(duì)親水性碳源葡萄糖和疏水性碳源正十六烷的降解均表現(xiàn)出差異。低濃度鼠李糖脂的吸附對(duì)菌體降解葡萄糖和單獨(dú)相正十六烷均有抑制作用；高濃度單糖脂吸附對(duì)菌體降解葡萄糖沒(méi)有影響，但使菌體對(duì)單獨(dú)相正十六烷的降解提前，并有可能導(dǎo)致了對(duì)十六烷不同的降解模式。雖然高濃度單糖脂膠團(tuán)化的正十六烷在菌體表面發(fā)生了吸附，但它在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)不能被降解，表明膠團(tuán)化的正十六烷在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)于該菌生物可利用性低。創(chuàng)新點(diǎn)和展望本論文研究有如下創(chuàng)新點(diǎn)：首次系統(tǒng)地研究了生物表面活性劑鼠李糖脂在微生物菌體上的吸附規(guī)律，綜合比較了因表面活性劑吸附質(zhì)和菌體吸附劑的差別引起的吸附規(guī)律的變化；探討了鼠李糖脂吸附處理下菌體表面親水疏水性的變化，揭示了鼠李糖脂的吸附與菌體表面親水疏水性的關(guān)聯(lián)，提出并初步證實(shí)了鼠李糖脂改變菌體表面親水疏水性的吸附機(jī)理；考察了鼠李糖脂在CMC附近的聚集體的溶液性質(zhì)，并觀察到了低于CMC下鼠李糖脂聚集體的形成及其行為特征；直接觀察到了鼠李糖脂膠團(tuán)與微生物菌體的相互作用。從本課題研究過(guò)程中的思考和對(duì)研究結(jié)果的分析出發(fā)，結(jié)合目前相關(guān)領(lǐng)域的研究趨勢(shì)以及實(shí)際應(yīng)用的需要，形成了如下幾點(diǎn)認(rèn)識(shí)和進(jìn)一步研究展望：1.關(guān)于生物表面活性劑分子與微生物菌體表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的作用機(jī)理。本論文研究主要考察的是生物表面活性劑鼠李糖脂在微生物菌體表面的吸附規(guī)律及吸附引起的菌體表面親水疏水性的變化，鼠李糖脂分子與菌體表面的作用方式作出了推斷，但并未涉及作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究，但它對(duì)采用生物表面活性劑技術(shù)調(diào)控菌體表面性質(zhì)并使之應(yīng)用于實(shí)際是不可缺少的。2.關(guān)于生物表面活性劑對(duì)微生物菌體的吸附改性在土壤原位修復(fù)中的應(yīng)用研究。添加外源高效菌種的HOCs污染土壤原位修復(fù)過(guò)程中，添加菌種在土壤介質(zhì)中向污染位的高效傳輸和在污染物上的富集是我們所期望的。生物表面活性劑對(duì)微生物菌體的表面改性作用有可能實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，且這種作用在低表面活性劑濃度下即可發(fā)生，使生物表面活性劑的應(yīng)用具有經(jīng)濟(jì)性。實(shí)現(xiàn)該方面應(yīng)用需要對(duì)改性菌體、土壤膠體和土壤污染物之間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究。3.關(guān)于生物表面活性劑的吸附對(duì)微生物菌體的毒性研究。關(guān)于生物表面活性劑的毒性已有報(bào)道，我們的研究結(jié)果證明，低濃度鼠李糖脂的吸附對(duì)其產(chǎn)生菌就有抑制作用。只有綜合考慮生物表面活性劑的吸附對(duì)降解微生物的毒理效應(yīng)才能使生物表面活性劑對(duì)菌體的改性作用得以成功應(yīng)用。4.關(guān)于低濃度下生物表面活性劑聚集體的結(jié)構(gòu)、形成機(jī)理研究以及它對(duì)HOCs增溶規(guī)律和膠團(tuán)化HOCs生物可利用性研究。我們的實(shí)驗(yàn)表明鼠李糖脂在低濃度下也能形成聚集體且對(duì)正十六烷具有較高的增溶效率，它可能是在低濃度下實(shí)現(xiàn)生物表面活性劑的物化作用的一個(gè)契機(jī)。攻讀學(xué)位期間的研究成果發(fā)表的論文[1]ZhongHua,ZengGuangming,YuanXingzhong,FuHaiyan,HuangGuohe,andRenFangyi.Adsorptionofdirhamnolipidonfourmicroorganismsandtheeffectoncellsurfacehydrophobicity.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2007,77:447-455(SCIIF2006=2.441,EI074510907605)[2]ZhongHua,ZengGuangming,LiuJianxiao,XuXiangmin,YuanXingzhong,FuHaiyan,HuangGuohe,LiuZhifengandDingYing.Adsorptionofmonorhamnolipidanddirhamnolipidontwopseudomonasaeruginosastrainsandtheeffectoncellsurfacehydrophobicity.AppliedMicrobiologyandBiotechnology(publishedonline)(SCIIF2006=2.441,EI)[3]ZhongHua,ZengGuangming,HuangGuohe,YuanXingzhong,FuHaiyan.Effectofrhamnolipidbrothonvegetablesubstratebiodegradationprocess.In:Energy&Environment——Aworldofchallengeandopportunitiesproceedingsoftheenerenv’2003conference,Changsha,China.Beijing&NewYork,SciencePress,2003:841-848(ISTP,EI06219898030)[4]ZengGuangming,ZhongHua,HuangGuohe,FuHaiyan.PhysicochemicalandmicrobiologicaleffectofbiosurfactantontheremediationofHOC-contaminatedsoil.ProgressinNaturalScience,2005,15(7):577-585(SCIIF2006=0.531,EI05319278633)[5]ZengGuangming,ZhongHua,FuHaiyan,YuanXingzhong,Huangguohe,LiuXiaolan,WangJing.Theeffectofbacterialadsorptionofrhamnolipidonthedegradationofglucose,aggregate-incorporatedhexadecaneandsingle-phasehexadecanebyaPseudomonasaeruginosastrain.AppliedandEnvironmentalMicrobiology(SubmittedonMarch25th2008).(SCIIF2006=3.532,EI)[6]ZhongHua,ZengGuangming,FuHaiyan,YuanXingzhong,Huangguohe.AqueousaggregationbehavioroflowconcentrationrhamnolipidaroundneutralpH.Langmuir(beinghandled).(SCIIF2006=3.902,EI)[7]

鐘華，曾光明，黃國(guó)和，傅海燕，王偉.鼠李糖脂對(duì)銅綠假單胞菌降解顆粒有機(jī)質(zhì)的影響.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2005，26(2)：201-205(EI06219898030)[8]

鐘華，曾光明，黃國(guó)和，傅海燕.生物表面活性劑對(duì)土壤中微生物降解疏水性有機(jī)物的作用機(jī)制.高技術(shù)通訊，2006，16(3)：325-330(EI06209882791)[9]FuHaiyan,ZengGuangming,ZhongHua,YuanXingzhong,HuangGuohe.Co-degradationwithglucoseoffoursurfactants,CTAB,TritonX-100,SDSandrhamnolipid.Biodegradation,2007,18(3):303-310(SCIIF2006=1.579)[10]YuanXingzhong,RenFangyi,ZengGuangming,ZhongHua,FuHaiyan,LiuJiaandXuXinmiao.AdsorptionofsurfactantsonaPseudomonasaeruginosastrainandtheeffectoncellsurfacelypohydrophilicproperty.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2007,76:1189-1198(SCIIF2006=2.441,EI073810820996)

[11]FuHaiyan,ZengGuangming,HuangGuohe,ZhongHua,YuanXingzhongandMengYouting.Isolatingbiosurfactant-producingbact