mofloXDP流式細(xì)胞儀基本原理以及應(yīng)用

流式細(xì)胞儀基本原理以及應(yīng)用

張宇eckmanCoulter細(xì)胞研究必備的儀器細(xì)胞成像、定位（單個細(xì)胞）細(xì)胞定量測定（群體細(xì)胞特征）分析型：一個細(xì)胞的身世：我是誰混雜的細(xì)胞群激光激發(fā)標(biāo)記在細(xì)胞上的熒光素Directlytowaste儀器的電子系統(tǒng)收集熒光信號并處理信號計算機工作站對信號進(jìn)行收集和統(tǒng)計流式細(xì)胞儀是通過對目標(biāo)細(xì)胞上的熒光信號進(jìn)行識別

而實現(xiàn)對細(xì)胞的定量一個細(xì)胞的命運混雜的細(xì)胞群身份的鑒定識別和通過的速度分選是一個復(fù)雜的過程流式細(xì)胞儀是細(xì)胞組學(xué)的定量工具可以做以下定量：細(xì)胞相對定量（％）細(xì)胞絕對定量（細(xì)胞/μl）細(xì)胞膜蛋白表達(dá)定量（蛋白分子/細(xì)胞）流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點細(xì)胞受體流式細(xì)胞儀基本原理通過激光激發(fā)高速流動的細(xì)胞或微粒所攜帶的熒光染料或熒光素，并檢測由此產(chǎn)生各種光信號，如散射光、自發(fā)熒光、特異性熒光的強弱，來反映各項待檢測指標(biāo)。成功的流式實驗需要三步走：下游實驗,培養(yǎng)或者其他生物手段驗證流式樣本制備單細(xì)胞懸液制備樣本保存熒光標(biāo)記設(shè)置對照單細(xì)胞懸液制備樣本濃度要求：建議105~106/ml血樣本樣本要求：EDTA、肝素、檸檬酸鈉抗凝全血凝血、溶血樣本應(yīng)當(dāng)棄用

白細(xì)胞樣本：需裂解去除紅細(xì)胞

裂解液的選擇：甲酸作用強，適用于一般檢測

氯化銨作用溫和，適用于低含量細(xì)胞

注意：溫度過低會影響裂解效果

紅細(xì)胞樣本：PBS或生理鹽水稀釋1000倍

血小板樣本：避免使用肝素抗凝血，PBS或生理鹽水稀釋20倍

培養(yǎng)細(xì)胞一般處理：消化分散成單細(xì)胞，過300目濾網(wǎng)去除細(xì)胞團塊易聚集的細(xì)胞：可在緩沖液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA

單細(xì)胞懸液制備組織細(xì)胞脾細(xì)胞，在緩沖液中將血洗凈，剪成數(shù)塊，直接在300目濾網(wǎng)上研碎過篩肝、腎組織及結(jié)腸癌等富含實質(zhì)細(xì)胞的組織，于緩沖液中充分剪碎，細(xì)胞分散于緩沖液中，過100目濾網(wǎng)，再過300目濾網(wǎng)

肺、腸粘膜等結(jié)締組織較多的組織，剪碎并用胰酶、膠原酶等消化分散骨、軟骨、心肌、骨骼肌、腦組織等，可嘗試機械剪碎及酶消化后于培養(yǎng)液中靜置貼壁分離細(xì)胞，但可用的細(xì)胞往往較少，最好進(jìn)行原代培養(yǎng)

單細(xì)胞懸液制備外周血樣本：在不處理的情況下于4度存放3~5天，仍可用于大多數(shù)表面分子標(biāo)記檢測。但做細(xì)胞絕對計數(shù)應(yīng)在24h內(nèi)檢測固定：低濃度的甲醛或多聚甲醛固定（<1%）可用于培養(yǎng)細(xì)胞或已分散成單細(xì)胞的組織來源樣本的短期保存（<1周）

過高濃度的甲醛會影響抗原抗體結(jié)合及導(dǎo)致熒光淬滅，不適合流式檢測長期保存：可參考細(xì)胞和組織的凍存（深低溫或液氮）DNA倍體檢測：可用-20度預(yù)冷乙醇固定（終濃度>80%），固定時震蕩逐滴加入，避免結(jié)塊，1~2ml/樣本，存放于-20度（>1月）注意：已標(biāo)記熒光的樣本和對細(xì)胞活力有要求的樣本應(yīng)盡快檢測，以免熒光淬滅及細(xì)胞活力喪失樣本保存熒光標(biāo)記表面抗原標(biāo)記：抗體用量106cells/test凍干粉可以0.5~1ug/106cells為起始量脂溶性染料：可直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)抗原標(biāo)記及水溶性染料：需要膜通透試劑處理膜通透試劑的選擇甲醇：中等，可能導(dǎo)致部分蛋白變性

皂素：溫和，對細(xì)胞形態(tài)影響小

Triton-X100：強烈，對細(xì)胞形態(tài)影響大

商品化試劑：含有上述多種成分，不同組合用途不同熒光素的選擇激發(fā)波長發(fā)射波長激光熒光通道熒光素的選擇

CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP<FITC<APC<

ECD<PC5<PC7<PE熒光素的強度熒光檢測通道之間的干擾FITC(F/PRatio3-5)PE(1/Antik?rper)389D240kDECD(F/PRatio1)PC5(F/PRatio1)240kD240kD240kDTexasRed=625DCy5=1500DCy7=1001DPerCP(F/PRatio3-5)35kDAPC(F/PRatio1)105kDPC7(F/PRatio1)熒光素的大小熒光素的選擇原則弱表達(dá)抗原選擇較“明亮”的熒光素細(xì)胞內(nèi)抗原檢測優(yōu)先選擇小分子熒光素多色檢測時弱表達(dá)抗原放在被干擾較小的檢測通道，強表達(dá)抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道表達(dá)互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道共表達(dá)的抗原避免放在相互干擾的通道上級抗原檢測通道避免對下級抗原檢測通道造成干擾SILENTUNTOUCHABLEUNTOUCHABLEUntouchable=其他染料沒有干擾(cleanrow)Silent=不會漏進(jìn)其他通道(cleancolumn)Distortion矩陣熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)

軟件的手動、自動補償和離線補償

FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2自動補償2134檢測的一般步驟設(shè)置檢測方案（PROTOCOL)染色標(biāo)本（同型對照，補償管，檢測抗體）同型對照管調(diào)電壓電壓不變，補償管調(diào)補償電壓不變，補償不變，上檢測管檢測后直接閱讀結(jié)果，確定分選目的細(xì)胞流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)Fluidicsopticselectronicsanalyzer液流系統(tǒng)Fluidics流體動力學(xué)聚焦原理管路設(shè)計光路系統(tǒng)激光濾光片光信號檢測器MoFloXDP光路精致設(shè)計，開放性強Filter前向散射角（FS）側(cè)向散射角（SS）電路系統(tǒng)如何看圖DotPlot（雙參數(shù)點圖）Histogram（單參數(shù)直方圖）Region（門）Statistics（統(tǒng)計結(jié)果）分選系統(tǒng)電極板分選倉分選原理（電荷式分選）晶體震動（200kHZ)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)收集裝置（管、孔板）MoFlo?XDP：噴嘴種類多，適合不同研究對象的需要

CytoNozzle

同等大小的羅紋卸載和安裝，簡單易用噴嘴內(nèi)壁由生物活性材料組成，對細(xì)胞無損傷，確保最好的細(xì)胞活性XDP細(xì)胞√染色體/精子/細(xì)菌/大病毒顆粒/藻類細(xì)胞（50um）√實驗動物細(xì)胞/人淋巴細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞（70-90um）√腫瘤細(xì)胞（100-130um）√巨噬細(xì)胞等真核生物細(xì)胞（150um）√植物/花粉/大藻類細(xì)胞（200um）Enrichmode要得到所有含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴Purifymode要得到所有含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴，但同時含有非目標(biāo)細(xì)胞的液滴除外Singlemode只要只含有一個目標(biāo)細(xì)胞的液滴目標(biāo)細(xì)胞非目標(biāo)細(xì)胞MoFlo:高度智能的分選模式Dropletscells液滴模式(Envolope)如下原則EnrichModeEnrichModePurifyModePurifyMode四路分選可以分別選擇不同的分選模式獨家的混合分選模式：四路分選分別選擇不同的模式

既有高純度細(xì)胞，又不浪費任何一個細(xì)胞XDPDataunpublishedShanghai右路：富集模式左路：純化模式Sortedat>70,000epsfor>2hrs

如何設(shè)門1.遠(yuǎn)離碎片，便于圈門2.分群不清晰，加大電壓軟件去除粘細(xì)胞適合所有應(yīng)用的細(xì)胞接收系統(tǒng)

分選角度定位

4路分選Cyclone克隆分選裝置支持任意廠家的標(biāo)準(zhǔn)6,24,96,384,1536微孔板,客戶定制的微孔板,波片客戶任意指定矩陣的細(xì)胞芯片，并且操作簡單SummitSoftwareWindowsXP

系統(tǒng)SUMMIT軟件涵蓋所有的數(shù)據(jù)和圖形處理功能SUMMIT軟件以數(shù)據(jù)庫儲存為基礎(chǔ)，支持自動補償，離線補償，多文件分析報告等最先進(jìn)流式軟件性能SUMMIT軟件完全開放安裝，可以分析所有國際標(biāo)準(zhǔn)LMD/FCS數(shù)據(jù)，方便使用SUMMIT軟件界面簡單，易學(xué)易用SUMMIT軟件獨有單參數(shù)圖顏色示蹤功能軟件對分選效果的影響軟件放大功能流式細(xì)胞儀的應(yīng)用支持最全面的生命科學(xué)研究內(nèi)容免疫功能研究（包括淋巴細(xì)胞亞群分析、細(xì)胞絕對計數(shù)、細(xì)胞活化、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、抗原特異性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞等）腫瘤相關(guān)研究（腫瘤相關(guān)基因表達(dá)、抗腫瘤藥物作用機制及多藥耐藥等）細(xì)胞周期和DNA倍體分析、細(xì)胞周期蛋白干細(xì)胞研究（干細(xì)胞的分離、鑒定、功能分析等）細(xì)胞治療藥物篩選、抗體研發(fā)，疫苗評估細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)染效率檢測磷酸化蛋白的檢測及信號傳導(dǎo)通路的研究細(xì)胞生理功能研究（死活鑒定、細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞內(nèi)鈣流、膜電位）細(xì)胞多色分選0.0017%極低含量的肝癌細(xì)胞系HuH7干細(xì)胞分析分選。獲取數(shù)量超過1300萬細(xì)胞，CD133陽性細(xì)胞含量低于1/10萬（0.0017%），總共收集到100多個細(xì)胞，直接注射裸鼠皮下進(jìn)行成瘤觀察Unpulisheddatashanghai極低含量的目標(biāo)細(xì)胞（十萬分之一）需要一次性海量獲取樣本細(xì)胞才能檢測到和分選到淋巴細(xì)胞亞群的分析和分選T淋巴細(xì)胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD8+CD28+抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá)/T細(xì)胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時此細(xì)胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細(xì)胞,感染時升高感染時升高活化T淋巴細(xì)胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+活化的B細(xì)胞過敏患者中升高

CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高

CD19+CD5+CD23+慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞

NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高

CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強烈征兆

注意事項1.裂紅完全SSFS2.CD45/SS設(shè)門分選CD44FITC/CD133PE細(xì)胞(腫瘤干細(xì)胞）從香港空運到上海的手術(shù)腫瘤切塊，分離成單個細(xì)胞后進(jìn)行染色、檢測和分選MoFloXDP，二軍大分選后的細(xì)胞皮下注射研究干細(xì)胞致瘤性SortedCD44SortedCD133兩個月后結(jié)果：表達(dá)CD44的細(xì)胞的致瘤性強于表達(dá)CD133的細(xì)胞MoFloXDP，二軍大細(xì)胞周期分析/DNA含量分析G0/G1SG2/MG0：靜止期，G1：DNA合成前期，S：DNA合成期G2：DNA合成后期，M：有絲分裂期推薦設(shè)門：注意事項：1.“細(xì)胞去哪里了”？2.固定必須用70%冰乙醇，固定時間2h以上3.乙醇清洗干凈，否則影響RNase的