mofloXDP流式細(xì)胞儀基本原理以及應(yīng)用

流式細(xì)胞儀基本原理以及應(yīng)用

張宇eckmanCoulter細(xì)胞研究必備的儀器細(xì)胞成像、定位（單個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞定量測(cè)定（群體細(xì)胞特征）分析型：一個(gè)細(xì)胞的身世：我是誰混雜的細(xì)胞群激光激發(fā)標(biāo)記在細(xì)胞上的熒光素Directlytowaste儀器的電子系統(tǒng)收集熒光信號(hào)并處理信號(hào)計(jì)算機(jī)工作站對(duì)信號(hào)進(jìn)行收集和統(tǒng)計(jì)流式細(xì)胞儀是通過對(duì)目標(biāo)細(xì)胞上的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別

而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的定量一個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)混雜的細(xì)胞群身份的鑒定識(shí)別和通過的速度分選是一個(gè)復(fù)雜的過程流式細(xì)胞儀是細(xì)胞組學(xué)的定量工具可以做以下定量：細(xì)胞相對(duì)定量（％）細(xì)胞絕對(duì)定量（細(xì)胞/μl）細(xì)胞膜蛋白表達(dá)定量（蛋白分子/細(xì)胞）流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體流式細(xì)胞儀基本原理通過激光激發(fā)高速流動(dòng)的細(xì)胞或微粒所攜帶的熒光染料或熒光素，并檢測(cè)由此產(chǎn)生各種光信號(hào)，如散射光、自發(fā)熒光、特異性熒光的強(qiáng)弱，來反映各項(xiàng)待檢測(cè)指標(biāo)。成功的流式實(shí)驗(yàn)需要三步走：下游實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)或者其他生物手段驗(yàn)證流式樣本制備單細(xì)胞懸液制備樣本保存熒光標(biāo)記設(shè)置對(duì)照單細(xì)胞懸液制備樣本濃度要求：建議105~106/ml血樣本樣本要求：EDTA、肝素、檸檬酸鈉抗凝全血凝血、溶血樣本應(yīng)當(dāng)棄用

白細(xì)胞樣本：需裂解去除紅細(xì)胞

裂解液的選擇：甲酸作用強(qiáng)，適用于一般檢測(cè)

氯化銨作用溫和，適用于低含量細(xì)胞

注意：溫度過低會(huì)影響裂解效果

紅細(xì)胞樣本：PBS或生理鹽水稀釋1000倍

血小板樣本：避免使用肝素抗凝血，PBS或生理鹽水稀釋20倍

培養(yǎng)細(xì)胞一般處理：消化分散成單細(xì)胞，過300目濾網(wǎng)去除細(xì)胞團(tuán)塊易聚集的細(xì)胞：可在緩沖液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA

單細(xì)胞懸液制備組織細(xì)胞脾細(xì)胞，在緩沖液中將血洗凈，剪成數(shù)塊，直接在300目濾網(wǎng)上研碎過篩肝、腎組織及結(jié)腸癌等富含實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組織，于緩沖液中充分剪碎，細(xì)胞分散于緩沖液中，過100目濾網(wǎng)，再過300目濾網(wǎng)

肺、腸粘膜等結(jié)締組織較多的組織，剪碎并用胰酶、膠原酶等消化分散骨、軟骨、心肌、骨骼肌、腦組織等，可嘗試機(jī)械剪碎及酶消化后于培養(yǎng)液中靜置貼壁分離細(xì)胞，但可用的細(xì)胞往往較少，最好進(jìn)行原代培養(yǎng)

單細(xì)胞懸液制備外周血樣本：在不處理的情況下于4度存放3~5天，仍可用于大多數(shù)表面分子標(biāo)記檢測(cè)。但做細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)應(yīng)在24h內(nèi)檢測(cè)固定：低濃度的甲醛或多聚甲醛固定（<1%）可用于培養(yǎng)細(xì)胞或已分散成單細(xì)胞的組織來源樣本的短期保存（<1周）

過高濃度的甲醛會(huì)影響抗原抗體結(jié)合及導(dǎo)致熒光淬滅，不適合流式檢測(cè)長(zhǎng)期保存：可參考細(xì)胞和組織的凍存（深低溫或液氮）DNA倍體檢測(cè)：可用-20度預(yù)冷乙醇固定（終濃度>80%），固定時(shí)震蕩逐滴加入，避免結(jié)塊，1~2ml/樣本，存放于-20度（>1月）注意：已標(biāo)記熒光的樣本和對(duì)細(xì)胞活力有要求的樣本應(yīng)盡快檢測(cè)，以免熒光淬滅及細(xì)胞活力喪失樣本保存熒光標(biāo)記表面抗原標(biāo)記：抗體用量106cells/test凍干粉可以0.5~1ug/106cells為起始量脂溶性染料：可直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)抗原標(biāo)記及水溶性染料：需要膜通透試劑處理膜通透試劑的選擇甲醇：中等，可能導(dǎo)致部分蛋白變性

皂素：溫和，對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響小

Triton-X100：強(qiáng)烈，對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響大

商品化試劑：含有上述多種成分，不同組合用途不同熒光素的選擇激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)激光熒光通道熒光素的選擇

CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP<FITC<APC<

ECD<PC5<PC7<PE熒光素的強(qiáng)度熒光檢測(cè)通道之間的干擾FITC(F/PRatio3-5)PE(1/Antik?rper)389D240kDECD(F/PRatio1)PC5(F/PRatio1)240kD240kD240kDTexasRed=625DCy5=1500DCy7=1001DPerCP(F/PRatio3-5)35kDAPC(F/PRatio1)105kDPC7(F/PRatio1)熒光素的大小熒光素的選擇原則弱表達(dá)抗原選擇較“明亮”的熒光素細(xì)胞內(nèi)抗原檢測(cè)優(yōu)先選擇小分子熒光素多色檢測(cè)時(shí)弱表達(dá)抗原放在被干擾較小的檢測(cè)通道，強(qiáng)表達(dá)抗原放在對(duì)其他通道干擾較小的檢測(cè)通道表達(dá)互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測(cè)通道共表達(dá)的抗原避免放在相互干擾的通道上級(jí)抗原檢測(cè)通道避免對(duì)下級(jí)抗原檢測(cè)通道造成干擾SILENTUNTOUCHABLEUNTOUCHABLEUntouchable=其他染料沒有干擾(cleanrow)Silent=不會(huì)漏進(jìn)其他通道(cleancolumn)Distortion矩陣熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)

軟件的手動(dòng)、自動(dòng)補(bǔ)償和離線補(bǔ)償

FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2自動(dòng)補(bǔ)償2134檢測(cè)的一般步驟設(shè)置檢測(cè)方案（PROTOCOL)染色標(biāo)本（同型對(duì)照，補(bǔ)償管，檢測(cè)抗體）同型對(duì)照管調(diào)電壓電壓不變，補(bǔ)償管調(diào)補(bǔ)償電壓不變，補(bǔ)償不變，上檢測(cè)管檢測(cè)后直接閱讀結(jié)果，確定分選目的細(xì)胞流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)Fluidicsopticselectronicsanalyzer液流系統(tǒng)Fluidics流體動(dòng)力學(xué)聚焦原理管路設(shè)計(jì)光路系統(tǒng)激光濾光片光信號(hào)檢測(cè)器MoFloXDP光路精致設(shè)計(jì)，開放性強(qiáng)Filter前向散射角（FS）側(cè)向散射角（SS）電路系統(tǒng)如何看圖DotPlot（雙參數(shù)點(diǎn)圖）Histogram（單參數(shù)直方圖）Region（門）Statistics（統(tǒng)計(jì)結(jié)果）分選系統(tǒng)電極板分選倉(cāng)分選原理（電荷式分選）晶體震動(dòng)（200kHZ)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)收集裝置（管、孔板）MoFlo?XDP：噴嘴種類多，適合不同研究對(duì)象的需要

CytoNozzle

同等大小的羅紋卸載和安裝，簡(jiǎn)單易用噴嘴內(nèi)壁由生物活性材料組成，對(duì)細(xì)胞無損傷，確保最好的細(xì)胞活性XDP細(xì)胞√染色體/精子/細(xì)菌/大病毒顆粒/藻類細(xì)胞（50um）√實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞/人淋巴細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞（70-90um）√腫瘤細(xì)胞（100-130um）√巨噬細(xì)胞等真核生物細(xì)胞（150um）√植物/花粉/大藻類細(xì)胞（200um）Enrichmode要得到所有含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴Purifymode要得到所有含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴，但同時(shí)含有非目標(biāo)細(xì)胞的液滴除外Singlemode只要只含有一個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的液滴目標(biāo)細(xì)胞非目標(biāo)細(xì)胞MoFlo:高度智能的分選模式Dropletscells液滴模式(Envolope)如下原則EnrichModeEnrichModePurifyModePurifyMode四路分選可以分別選擇不同的分選模式獨(dú)家的混合分選模式：四路分選分別選擇不同的模式

既有高純度細(xì)胞，又不浪費(fèi)任何一個(gè)細(xì)胞XDPDataunpublishedShanghai右路：富集模式左路：純化模式Sortedat>70,000epsfor>2hrs

如何設(shè)門1.遠(yuǎn)離碎片，便于圈門2.分群不清晰，加大電壓軟件去除粘細(xì)胞適合所有應(yīng)用的細(xì)胞接收系統(tǒng)

分選角度定位

4路分選Cyclone克隆分選裝置支持任意廠家的標(biāo)準(zhǔn)6,24,96,384,1536微孔板,客戶定制的微孔板,波片客戶任意指定矩陣的細(xì)胞芯片，并且操作簡(jiǎn)單SummitSoftwareWindowsXP

系統(tǒng)SUMMIT軟件涵蓋所有的數(shù)據(jù)和圖形處理功能SUMMIT軟件以數(shù)據(jù)庫(kù)儲(chǔ)存為基礎(chǔ)，支持自動(dòng)補(bǔ)償，離線補(bǔ)償，多文件分析報(bào)告等最先進(jìn)流式軟件性能SUMMIT軟件完全開放安裝，可以分析所有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)LMD/FCS數(shù)據(jù)，方便使用SUMMIT軟件界面簡(jiǎn)單，易學(xué)易用SUMMIT軟件獨(dú)有單參數(shù)圖顏色示蹤功能軟件對(duì)分選效果的影響軟件放大功能流式細(xì)胞儀的應(yīng)用支持最全面的生命科學(xué)研究?jī)?nèi)容免疫功能研究（包括淋巴細(xì)胞亞群分析、細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、細(xì)胞活化、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、抗原特異性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞等）腫瘤相關(guān)研究（腫瘤相關(guān)基因表達(dá)、抗腫瘤藥物作用機(jī)制及多藥耐藥等）細(xì)胞周期和DNA倍體分析、細(xì)胞周期蛋白干細(xì)胞研究（干細(xì)胞的分離、鑒定、功能分析等）細(xì)胞治療藥物篩選、抗體研發(fā)，疫苗評(píng)估細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)磷酸化蛋白的檢測(cè)及信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究細(xì)胞生理功能研究（死活鑒定、細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞內(nèi)鈣流、膜電位）細(xì)胞多色分選0.0017%極低含量的肝癌細(xì)胞系HuH7干細(xì)胞分析分選。獲取數(shù)量超過1300萬細(xì)胞，CD133陽性細(xì)胞含量低于1/10萬（0.0017%），總共收集到100多個(gè)細(xì)胞，直接注射裸鼠皮下進(jìn)行成瘤觀察Unpulisheddatashanghai極低含量的目標(biāo)細(xì)胞（十萬分之一）需要一次性海量獲取樣本細(xì)胞才能檢測(cè)到和分選到淋巴細(xì)胞亞群的分析和分選T淋巴細(xì)胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD8+CD28+抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá)/T細(xì)胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞病菌感染時(shí)升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細(xì)胞,感染時(shí)升高感染時(shí)升高活化T淋巴細(xì)胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+活化的B細(xì)胞過敏患者中升高

CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高

CD19+CD5+CD23+慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞

NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時(shí)降低,而病毒感染時(shí)升高

CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆

注意事項(xiàng)1.裂紅完全SSFS2.CD45/SS設(shè)門分選CD44FITC/CD133PE細(xì)胞(腫瘤干細(xì)胞）從香港空運(yùn)到上海的手術(shù)腫瘤切塊，分離成單個(gè)細(xì)胞后進(jìn)行染色、檢測(cè)和分選MoFloXDP，二軍大分選后的細(xì)胞皮下注射研究干細(xì)胞致瘤性SortedCD44SortedCD133兩個(gè)月后結(jié)果：表達(dá)CD44的細(xì)胞的致瘤性強(qiáng)于表達(dá)CD133的細(xì)胞MoFloXDP，二軍大細(xì)胞周期分析/DNA含量分析G0/G1SG2/MG0：靜止期，G1：DNA合成前期，S：DNA合成期G2：DNA合成后期，M：有絲分裂期推薦設(shè)門：注意事項(xiàng)：1.“細(xì)胞去哪里了”？2.固定必須用70%冰乙醇，固定時(shí)間2h以上3.乙醇清洗干凈，否則影響RNase的