生化工藝第三章培養(yǎng)基的選擇與滅菌1

生物化工工藝學

第三章培養(yǎng)基的選擇與滅菌任課教師：陳磊祥谷氨酸和味精生產(chǎn)工藝的培養(yǎng)基淀粉水解后的糖化液玉米漿糖蜜無機鹽其它培養(yǎng)基的定義提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質的混合物。一、概述

葡萄糖或乳糖總量的10%玉米漿4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%豬油或植物油（消泡劑）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水生產(chǎn)青霉素工藝培養(yǎng)基從上面例子可看出，發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分包括碳源如葡萄糖、淀粉；氮源如硫酸銨、玉米漿；無機鹽和微量元素；前體和誘導物等。一個良好的培養(yǎng)基配方組成是經(jīng)過較長時間的研究并經(jīng)過一定時間的生產(chǎn)實踐之后確認的，但并不是一成不變的，它也要隨著生產(chǎn)菌種的不斷改良、發(fā)酵工藝條件的不斷改進以及發(fā)酵罐結構的不同而不斷地改進、調(diào)整、趨于完善，以達到充分發(fā)揮菌種最大的生產(chǎn)潛力。

補充1：微生物細胞的化學組成及胞外代謝產(chǎn)物

1、微生物細胞的化學組成微生物成分細菌（%）酵母菌（%）霉菌（%）水分75-8570-8085-90蛋白質50-80（干重）72-7514-15碳水化合物12-2827-637-40脂肪5-202-154-40核酸10-206-81無機元素2-303.8-76-12由表可知，微物細胞含有80%左右的水分和20%左右的干物質，它主要是由C、H、O和N等元素組成，約占全部干物質的90%至97%，此外還含有各種無機礦物質，依次為：PKMgCaSNa及微量元素。

營養(yǎng)物質的確定，主要依據(jù)細胞的化學組成及所代謝物的化學組成。因此，分析微生物細胞的化學組成是了解微生物營養(yǎng)的基礎。2、微生物胞外代謝產(chǎn)物

微生物在生長過程中，除利用外源營養(yǎng)物質合成新的細胞外，還會產(chǎn)生一些有機化合物分泌到微生物的體外，這些胞外代謝產(chǎn)物的種類繁多，且因微生物的種類而異。因此，了解這些代謝產(chǎn)物的化學組成，極有助于微生物培養(yǎng)時的營養(yǎng)物質的選擇和代謝產(chǎn)物的積累。一般來說，微生物的胞外代謝產(chǎn)物的主要包括下面四個部分。1）代謝副產(chǎn)物

這類產(chǎn)物主要是指伴隨微生物細胞正常代謝作用所產(chǎn)生的一些小分子化合物。如：CO2、H2、CH4等氣體和乙醇、丙酮、丁醇、丙酸、乳酸等低分子量的醇類、脂肪酸類和酮類，其中許多物質是重要的化工原料。

產(chǎn)物名稱用途主要生產(chǎn)菌甲烷能源奧式甲烷桿菌乙醇、異丙醇醫(yī)藥、化工原料、飲料等酵母菌異丙醇、丙酮、丁醇防凍劑、火膠溶劑、樹膠等丁酸梭菌丙酮、丁醇、甘油重要的有機溶劑丙酮丁醇梭菌甘油、甘露醇溶劑、潤滑劑、化妝品、硝化甘油炸藥醇母菌甘露醇、乙酸合成樹脂、增韌劑等曲霉菌乙酸食醋、化工原料產(chǎn)醋酸桿菌草酸印染、漂洗皮革、制造塑料和染料曲霉菌和青霉菌乳酸食品乳酸醫(yī)藥和化工原料乳酸菌2）中間代謝產(chǎn)物

指細胞在代謝途徑中產(chǎn)生的用于合成蛋白質、核酸、類脂和多糖等細胞物質的一些小分子物質。如氨基酸、核苷酸、有機酸和單糖的衍生物。中間代謝產(chǎn)物一般不分泌到微生物體外，而只有當微生物細胞生物合成受阻或外源碳源濃度較高的情況下，才會有大量的積累和外流。不少中間代謝產(chǎn)物也是重要的食品和化工原料。

產(chǎn)物名稱用途主要產(chǎn)生菌延胡索酸抗氧劑、合成樹脂、染料黑根霉琥珀酸制漆、染料根霉菌蘋果酸食品黑曲霉檸檬酸飲料、化工原料黑曲霉核黃素醫(yī)藥棉病囊霉谷氨酸味精谷氨酸棒桿菌肌苷酸調(diào)味品產(chǎn)氨短桿菌3）次級代謝產(chǎn)物

這類代謝產(chǎn)物是指由微生物細胞合成的，分子比較復雜的一些化合物，它既不參與細胞的組成，又不是酶的活性基團，也不是細胞的儲存物質，它們中的大多數(shù)分泌于微生物的體外。

如抗生素、毒素、激素和色素等幾類

4）

胞外水解酶類

許多微生物可產(chǎn)生胞外水解酶類。這類水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構酶等?？捎糜谑称?、釀造、紡織、制革、醫(yī)藥和生化試劑等各個領域。初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物包括哪些物質？問題補充2：微生物的營養(yǎng)物質和營養(yǎng)類型

微生物四大營養(yǎng)類型

光能自養(yǎng)型光能異養(yǎng)型化能自養(yǎng)型化能異養(yǎng)型微生物六大營養(yǎng)要素碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽、水專性好氣微生物。這類微生物只能在有空氣或有氧的條件下才能生長，包括了全部的霉菌、大部分的放線菌及部分的細菌。專性厭氣微生物。這類微生物只能在沒有空氣或無氧的條件下才能生長，包括了部分細菌、放線菌。兼性微生物。這類微生物既生物既在空氣或有氧的條件下生長，又能在沒有空氣或無氧的條件下生長，包括了酵母菌及部分細菌。問題3根據(jù)微生物對氧的要求，微生物可分為哪幾類？二、培養(yǎng)基的成分重點內(nèi)容生產(chǎn)青霉素工藝培養(yǎng)基從微生物的營養(yǎng)要求來看，所有的微生物都需要水、能源、碳源、無機元素及生長輔助物質，如果是好氧微生物則還需要氧氣。在實驗室規(guī)模上配制含有純化合物的培養(yǎng)基是相當簡單的，雖然它能滿足微生物的生長要求，但在大規(guī)模生產(chǎn)上往往是不適合的。

葡萄糖或乳糖總量的10%玉米漿4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%豬油或植物油（消泡劑）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水在發(fā)酵工業(yè)中，必須使用廉價的原料來配制培養(yǎng)基，盡可能地滿足下列條件：每克消耗的底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率；能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度；能得到產(chǎn)物形成的最大速率；副產(chǎn)品的得率最??；價廉并具有穩(wěn)定的質量；來源豐富且供應充足；在通氣和攪拌、提取、純化、廢物處理及生產(chǎn)工藝過程都比較容易。1、工業(yè)上經(jīng)常使用的碳源

在微生物發(fā)酵過程中，普遍以碳水化合物（各種糖類）、脂肪、有機酸和醇、碳氫化合物等作為碳源。使用最廣的碳水化合物是玉米淀粉，也可使用來自其他谷物、馬鈴薯、木薯的淀粉。淀粉可用稀酸和酶快速水解產(chǎn)生不同的葡萄糖制備物。表3-2微生物發(fā)酵生產(chǎn)中使用的糖類

霉菌和放線菌還可以用油脂作碳源。一般地說，在培養(yǎng)基中糖類缺乏或發(fā)酵至某一階段，菌體可以利用油脂。常見的油脂主要指動、植物油，如豆油、玉米油、棉子油和豬油等。在發(fā)酵過程中加入的油脂起消沫和補充碳源的雙重作用。菌體利用油脂作碳源時耗氧量增加，因此必須充分地供氧，否則易導致有機酸積累，發(fā)酵液的pH值降低。油脂在貯藏過程中易酸敗，同時還可能增加過氧化物的含量，對微生物的代謝有毒副作用。使用時注意將油脂貯藏在低溫條件下，貯藏時間不宜過長。問：發(fā)酵過程中加入的油脂起有何作用？使用時應注意什么？填表：生產(chǎn)菌最優(yōu)先C源嗜甲烷棒狀桿菌乳糖發(fā)酵短桿菌3790青霉素發(fā)酵抗生素和甾類轉化的發(fā)酵維生素C發(fā)酵2、工業(yè)上經(jīng)常使用的氮源

工業(yè)生產(chǎn)上所用的微生物都能利用無機或有機氮源，無機氮源包括了氮氣、銨鹽或硝酸鹽等。有機氮源包括了玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽粉、酒精干燥可溶物、酪蛋白水解液、屠場廢物、魚粉、酵母浸出液等。一般來講，有機氮源更有利于微生物生長。玉米漿是玉米提取玉米淀粉后留下的副產(chǎn)品。1、無機N源包括哪些？有何特點？問題2、為什么說微生物吸收利用銨鹽比硝酸鹽的能力強？3、無機N源是如何改變培養(yǎng)液的pH的？(NH4)2SO4→2NH3＋H2SO4NaNO3＋4H2→NH3＋H2O＋NaOH4、什么叫生理酸性物質和生理堿性物質？舉例說明。1、有機N源包括哪些？有何特點？問題1）成分比較復雜

2）被菌體利用的速度不同3）微生物對氨基酸的利用有選擇性

4）是引起發(fā)酵水平波動的主要因素

3、無機鹽和微量元素

工業(yè)生產(chǎn)上，常使用合成培養(yǎng)基，因此需要添加諸如鎂、磷、鉀、硫、鈣、鈷、銅等微量元素。

常用無機鹽：KH2PO4MgSO4·7H2OKClCaCO3CuSO4·5H2O等。分別有不同作用。問題許多金屬離子對微生物生理活性的作用與其濃度相關，低濃度時往往呈現(xiàn)刺激作用，高濃度卻表現(xiàn)出抑制作用，舉例說明。如青霉素發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的鐵離子（Fe2+）濃度為6μg/ml時，不影響青霉素的生物合成，當Fe2+濃度達60μg/ml時，青霉素產(chǎn)量下降30%，當Fe2+濃度達300μg/ml時，產(chǎn)量下降90%。鋅、鎂、鈷等是某些酶的輔酶或激活劑。微量的鋅對青霉素發(fā)酵有促進作用，過量時呈現(xiàn)抑制作用。4、水水是菌體生長所必不可少的，它構成培養(yǎng)基的主要組成成分。水在細胞中的生理功能主要有：①起到溶劑與運輸介質的作用，營養(yǎng)物質的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌必須以水為介質才能完成；②參與細胞內(nèi)一系列化學反應；③維持蛋白質、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構象；④因為水的比熱高，是熱的良好導體，能有效地吸收代謝過程中產(chǎn)生的熱并及時地將熱迅速散發(fā)出體外，進而有效地控制細胞內(nèi)溫度的變化；⑤保持充足的水分是細胞維持自身正常形態(tài)的重要因素；⑥微生物通過水合作用與脫水作用控制由多亞基組成的結構，如酶、微管、鞭毛及病毒顆粒的組裝與解離。5、前體物質和促進劑工業(yè)發(fā)酵過程中通常要添加一些有助于產(chǎn)物的形成，而對菌體生長影響不大的前體物質、抑制劑或誘導劑等代謝調(diào)節(jié)物質。注意：這些物質加入到培養(yǎng)基中有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進微生物的生長。閱讀P34-37，回答問題1）抗生素發(fā)酵常用前體物質有哪些？4）名詞：前體物質、促進劑？2）在青霉素的生產(chǎn)過程中，為什么加入玉米漿后，青霉素的單位有很大提高？3）前體物質是否加越多越好？5）在培養(yǎng)基中添加哪些微量的促進劑可大大地增加某些微生物酶的產(chǎn)量？有些工業(yè)酶多數(shù)為誘導酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等。誘導物的存在能大大促進誘導酶的生物合成。酶的正常底物或底物的類似物都可作為誘導物，如淀粉、糊精或麥芽糖是淀粉酶或糖化酶的誘導物。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基中必須加入誘導物。一些工業(yè)上重要的酶誘導物微生物產(chǎn)物酶誘導物曲霉菌產(chǎn)氣氣桿菌灰色鏈霉菌大腸桿菌枯草桿菌鏈球菌鏈霉菌曲霉菌毛霉菌綠色木霉曲霉菌α-淀粉酶普魯藍酶α-甘露糖酶青霉素?；傅鞍酌傅鞍酌傅鞍酌傅鞍酌傅鞍酌咐w維素酶果膠酶淀粉、麥芽糖麥芽糖酶母甘露糖苯乙酸許多蛋白質許多蛋白質許多蛋白質許多蛋白質許多蛋白質纖維素果膠6）常用的促進劑有哪些？7）名詞：抑制劑？舉例說明發(fā)酵過程中使用的一些抑制劑微生物產(chǎn)物抑制劑主要作用啤酒酵母金霉素鏈霉菌谷氨酸小球菌黑曲霉中海諾卡氏菌甘油四環(huán)素谷氨酸檸檬酸利福霉素B亞硫酸鈉溴青霉素堿金屬、磷酸二乙巴妥鹽阻止乙醛的生成阻止氯四環(huán)素的產(chǎn)生增加細胞壁透性草酸被抑制其他利福霉素被抑制6、消沫劑1）在發(fā)酵中，為什么要加消泡劑，常用哪些物質？7、其他成分微生物生長繁殖需要的生長因子如維生素等，在所使用的碳源和有機氮源中含有的數(shù)量已能滿足絕大多數(shù)微生物代謝的需求，但某些微生物的培養(yǎng)基尚需加入某些微量生長因子，以滿足其代謝的需要。以青霉素培養(yǎng)基為例，說說各成分的作用？復習：生產(chǎn)青霉素工藝培養(yǎng)基葡萄糖或乳糖總量的10%玉米漿4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%豬油或植物油（消泡劑）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水第二節(jié)、培養(yǎng)基的種類與選擇根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途不同，可將培養(yǎng)基分成：

分離純化、原生質體再生、增殖、選擇和鑒別培養(yǎng)基

根據(jù)培養(yǎng)基狀態(tài)不同，可將培養(yǎng)基分成：

固體、液體和半固體培養(yǎng)基

根據(jù)營養(yǎng)物質的來源不同，培養(yǎng)基可分為：

天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基

問題2固體培養(yǎng)基與半固體培養(yǎng)基是如何界定的？問題1發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基屬于哪一類培養(yǎng)基？1、培養(yǎng)基的分類生化生產(chǎn)中常用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基問題2起到什么作用？培養(yǎng)基配制時有哪些要求？舉例問題1起到什么作用？培養(yǎng)基配制時有哪些要求？舉例問題3起到什么作用？培養(yǎng)基配制時有哪些要求？第四講開始注）培養(yǎng)基的配制原則根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的恰當配比（C/N）滲透壓

PH值氧化還原電位2、培養(yǎng)基的設計3、培養(yǎng)基的篩選理論計算法統(tǒng)計法（單因子試驗法、正交試驗設計和均勻試驗設計）連續(xù)培養(yǎng)法什么叫細胞產(chǎn)率系數(shù)？名詞消耗1克碳源底物產(chǎn)生的干微生物細胞克數(shù)。1、理論計算法碳源和能源＋氮源＋其它所需物質細胞＋產(chǎn)物＋CO2＋H2O＋熱量2、統(tǒng)計法因子水平

A葡萄糖

%

B豆餅水解液%

C玉米漿%

D硫酸氨

%

1

2

31012.515234123543賴氨酸發(fā)酵試驗水平和因素表3、連續(xù)培養(yǎng)法培養(yǎng)時間光密度（菌體濃度）