生化檢驗(yàn)第五章酶

第五章

診斷酶學(xué)第一節(jié)概述第二節(jié)酶測(cè)定技術(shù)第三節(jié)常用酶及同工酶測(cè)定的臨床應(yīng)用教學(xué)目的

掌握臨床診斷中常用的血清酶及其同工酶掌握酶、工具酶、同工酶等定義；酶活性測(cè)定方法及注意事項(xiàng)。熟悉血清酶基本知識(shí)掌握急性心肌梗塞、肝膽疾病的酶的種類(lèi)、酶學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)、及其評(píng)價(jià)了解酶的概念、特征等。第一節(jié)

概述

Briefintroduction

一、酶的概念與特征（一）酶的組成、結(jié)構(gòu)和功能1.酶的本質(zhì)和特性酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的，具有催化功能的生物大分子物質(zhì)，其化學(xué)本質(zhì)絕大部分為蛋白質(zhì)，少數(shù)為核酸（核酶、脫氧核酶）酶的催化特性：極高的催化效率;高度的特異性;催化作用的可調(diào)節(jié)性。酶促反應(yīng)：酶催化的反應(yīng)；酶活性(activity)：酶催化反應(yīng)的能力；底物(substrate，S)：酶所作用的物質(zhì)；產(chǎn)物(product，P)：酶促反應(yīng)的生成物；酶的激活劑(activator）：加速酶促反應(yīng)的物質(zhì)；酶的抑制劑(inhibitor）：減慢或終止酶促反應(yīng)的物質(zhì)本質(zhì)：絕大部分是蛋白質(zhì)，少部分酶蛋白復(fù)合物與核酶.決定反應(yīng)的性質(zhì)和反應(yīng)類(lèi)型

決定反應(yīng)的特異性及其催化機(jī)制

蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)輔助因子(cofactor)

金屬離子小分子有機(jī)化合物結(jié)合酶（全酶)(holoenzyme)2.酶的結(jié)構(gòu)與功能

結(jié)合酶

(conjugatedenzyme)

單純酶(simpleenzyme)

輔助因子分類(lèi)（按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度與作用特點(diǎn)）

輔酶(coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。（小分子有機(jī)化合物）

輔基(prostheticgroup):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。（金屬離子）

金屬離子是最多見(jiàn)的輔助因子概念：酶的活性中心是指酶分子結(jié)構(gòu)中，能與底物結(jié)合，并使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。酶活性中心是酶分子中具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，或?yàn)榱芽p，或?yàn)榘枷荩钊氲矫阜肿觾?nèi)部，常為氨基酸殘基的疏水基團(tuán)組成的。（二）酶的催化作用機(jī)制1.酶的活性中心:一般催化劑反應(yīng)活化能反應(yīng)總能量變化酶促反應(yīng)活化能非催化反應(yīng)活化能初態(tài)終態(tài)能量改變活化過(guò)程酶促反應(yīng)降低活化能過(guò)渡態(tài)酶促反應(yīng)總結(jié)：1、為何具有高度催化效率——降低反應(yīng)活化能2、如何降低活化能——形成中間產(chǎn)物3、如何形成中間產(chǎn)物——誘導(dǎo)契合作用1.習(xí)慣命名法——推薦名稱(chēng)，由發(fā)現(xiàn)者命名，常以底物名、反應(yīng)性質(zhì)以及酶的來(lái)源命名；

2.系統(tǒng)命名法——系統(tǒng)名稱(chēng)，（1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)確定）每一個(gè)酶由下列三種表示：1）、系統(tǒng)名稱(chēng)：底物名+反應(yīng)性質(zhì)2）、分類(lèi)編號(hào)：E.C.+四個(gè)數(shù)字3）、推薦名：選一個(gè)習(xí)慣名（實(shí)用、簡(jiǎn)單）（三）酶的命名1、氧化還原酶（1）AH2＋B＝A＋BH22、轉(zhuǎn)移酶

（2）AB＋C＝A＋BC3、水解酶

（3）AB＋H2O＝AOH＋BH4、裂合酶（4）AB＝A＋B5、異構(gòu)酶

（5）A＝B6、連接酶或合成酶（6）A＋B＋ATP＝AB＋ADP＋Pi

或A＋B＋ATP＝AB＋AMP＋PPi六大類(lèi)編號(hào)依次為1.2.3.4.5.6亞類(lèi)編號(hào)依次為

1.2.3.4.5.6…….亞－亞類(lèi)編號(hào)依次為1.2.3.4.5.6…….酶的分類(lèi)（四）酶的分類(lèi)與編號(hào)

同工酶是同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類(lèi)酶。

二、同工酶的概念與特征

心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345*生理及臨床意義在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；用于解釋發(fā)育過(guò)程中階段特有的代謝特征；同工酶譜的改變有助于對(duì)疾病的診斷；同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。

肌酸激酶乳酸脫氫酶堿性磷酸酶酸性磷酸酶γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶α-淀粉酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶糖原磷酸化酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶果糖二磷酸醛縮酶β-N-乙酰(基)-D氨基葡萄糖苷酶概念：在酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱(chēng)為工具酶。三、工具酶

縮寫(xiě)符號(hào)名稱(chēng)縮寫(xiě)符號(hào)名稱(chēng)HDL乳酸脫氫酶HK已糖激酶MDH蘋(píng)果酸脫氫酶CK肌酸激酶G-6-PD6-磷酸葡萄糖脫氫酶PK丙酮酸激酶GLDH谷氨酸脫氫酶GK甘油激酶GOD葡萄糖氧化酶LPL脂蛋白脂肪酶COD膽固醇氧化酶CE膽固醇酯酶GPD磷酸甘油氧化酶POD過(guò)氧化物酶

常用工具酶的名稱(chēng)及其縮寫(xiě)符號(hào)一類(lèi)是氧化酶系統(tǒng)，利用氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2），再加上氧化發(fā)色劑進(jìn)行比色，如常用的Tinder反應(yīng)。另一類(lèi)是脫氫酶系統(tǒng)，利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反應(yīng)后，通過(guò)分光光度法或其他方法直接測(cè)定NAD(P)H的變化量。（一）工具酶參與的指示反應(yīng)（共通反應(yīng)途徑）葡萄糖氧化酶法：

準(zhǔn)確度和精密度都能達(dá)到臨床要求，操作簡(jiǎn)便，適用于常規(guī)檢驗(yàn)。此反應(yīng)稱(chēng)Trinder反應(yīng)，本法為國(guó)內(nèi)推薦方法。葡萄糖+2H2O+O2葡糖酸內(nèi)酯+2H2O24-AA+酚

+H2O2紅色醌類(lèi)化合物+H2OPODGOD常見(jiàn)的脫氫酶指示反應(yīng)(二）酶循環(huán)法（enzymaticcyclingmethods）

采用兩種工具酶進(jìn)行循環(huán)催化反應(yīng)，使被測(cè)物放大擴(kuò)增，從而提高測(cè)定的靈敏度。

(三）代謝物濃度的酶法測(cè)定技術(shù)由于酶作用的特異性，成分復(fù)雜的血清等體液樣品往往不需要進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)溫和的酶促反應(yīng)條件，簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)程序，即可對(duì)各種代謝物濃度進(jìn)行定量分析。終點(diǎn)法動(dòng)力學(xué)法

Km值:Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。a)

Km是酶的特征性常數(shù)之一；Km可近似表示酶對(duì)底物的親和力；Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高c)

同一酶對(duì)于不同底物有不同的Km值。第二節(jié)

酶測(cè)定技術(shù)正常人血中大部分酶一般在pg-ng水平，直接測(cè)定酶蛋白是十分困難的常用酶學(xué)測(cè)定方法利用酶有加速化學(xué)反應(yīng)的特性，通過(guò)測(cè)定被加速反應(yīng)的反應(yīng)速率，根據(jù)酶促反應(yīng)的底物減少量或產(chǎn)物增加量，來(lái)計(jì)算酶活性濃度的高低酶活性濃度的測(cè)定方法有量氣法、分光光度法、熒光法、電極法、放射性核素法酶活性濃度測(cè)定就是要使酶促反應(yīng)的初速度（v）達(dá)到最大速度Vmax，即在過(guò)量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期的速度，此時(shí)反應(yīng)速度與酶濃度[E]之間存在線性關(guān)系。按照酶促反應(yīng)時(shí)間的不同可將酶活性濃度測(cè)定方法分為兩大類(lèi):定時(shí)法（fixedtimeassay）連續(xù)監(jiān)測(cè)法（continuousmonitoringassay）。

一、酶活性測(cè)定(一)定時(shí)法（fixedtimeassay）

（兩點(diǎn)法）

測(cè)定酶與底物作用反應(yīng)一定時(shí)間后底物或產(chǎn)物變化的總量，計(jì)算酶促反應(yīng)平均速度。優(yōu)點(diǎn)：比較簡(jiǎn)單，所用儀器無(wú)需恒溫裝置，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)：無(wú)法知道是否處于線性期。

利用該法測(cè)定酶活性濃度，應(yīng)先作預(yù)試驗(yàn)，了解線性反應(yīng)期所在的時(shí)間段。在這段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，作用時(shí)間要非常精確，否則會(huì)引起較大誤差。精確作用時(shí)間在線性反應(yīng)期內(nèi)每次測(cè)定的作用時(shí)間應(yīng)相等V=△A△T

(二)連續(xù)監(jiān)測(cè)法continuousmonitoringassay又稱(chēng)速率法或動(dòng)力學(xué)法，指在酶促反應(yīng)過(guò)程中用儀器監(jiān)測(cè)某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化量，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)須終止酶促反應(yīng)，不需添加其它成色試劑，就能將反應(yīng)物變化的多點(diǎn)測(cè)定結(jié)果連接成線，觀察到整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，選擇線性反應(yīng)期來(lái)計(jì)算酶活性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

要求檢測(cè)儀器具有恒溫裝置及自動(dòng)檢測(cè)功能，自動(dòng)生化分析儀都能達(dá)到這些要求。

連續(xù)監(jiān)測(cè)法的時(shí)間進(jìn)程曲線連續(xù)監(jiān)測(cè)法的種類(lèi)

直接法

是指待測(cè)酶酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物有特征性的理化性質(zhì)，然后通過(guò)特殊的儀器直接檢測(cè)。

間接法

是指酶促反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間沒(méi)有特征性的理化性質(zhì)，需通過(guò)另一個(gè)化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)，將底物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有明顯特征理化性質(zhì)的另一個(gè)化合物。

L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD在反應(yīng)過(guò)程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同時(shí)使NAD+還原為NADH，NADH在340nm處有吸收峰，因此反應(yīng)會(huì)引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率與樣本中活性呈正比關(guān)系。直接法測(cè)定乳酸脫氫酶的活性

化學(xué)法

在反應(yīng)體系中加入一種試劑，該試劑只與酶反應(yīng)物作用，產(chǎn)生可被測(cè)量的物質(zhì)變化，該試劑不和酶反應(yīng)，也不影響酶的活性。酶偶聯(lián)法在原反應(yīng)體系中加入一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)體系，與被測(cè)定的酶反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)

Ex為待測(cè)酶，A為底物，B為中間產(chǎn)物。A、B二物質(zhì)的變化無(wú)法直接監(jiān)測(cè)，此時(shí)可外加第二個(gè)酶Ei(為指示酶)，其底物為B，反應(yīng)產(chǎn)物為C可直接測(cè)定。

酶偶聯(lián)反應(yīng)

最簡(jiǎn)單的模式為：CBAEiEx??????

輔助反應(yīng)

如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連在一起，此反應(yīng)稱(chēng)為輔助反應(yīng)。模式為：

其中，B、C均為中間產(chǎn)物，Ea、Ei都為工具酶。最后一個(gè)酶稱(chēng)指示酶Ei，其他外加的酶都為輔助酶（Ea）。DCBAEiEaEx?????????酶偶聯(lián)反應(yīng)原理當(dāng)用酶偶聯(lián)法測(cè)定時(shí)，在偶聯(lián)反應(yīng)中存在幾個(gè)時(shí)期：預(yù)孵育期、延滯期、恒態(tài)期、非恒態(tài)期。延滯期是酶偶聯(lián)反應(yīng)與一般酶反應(yīng)的一個(gè)重要區(qū)別。從酶反應(yīng)開(kāi)始至穩(wěn)態(tài)期間，指示酶反應(yīng)較慢且不穩(wěn)定，稱(chēng)為延滯期。在這期間指示酶反應(yīng)速度不能代表測(cè)定酶量多少。設(shè)計(jì)和選擇酶偶聯(lián)測(cè)定方法時(shí)，延滯期越短越好，測(cè)定時(shí)間要避開(kāi)此期。

對(duì)酶偶聯(lián)反應(yīng)的要求待測(cè)酶反應(yīng)必須是零級(jí)反應(yīng)，指示酶反應(yīng)必須是一級(jí)反應(yīng)指示酶反應(yīng)速度與指示酶底物濃度(待測(cè)酶的產(chǎn)物)成正比指示酶反應(yīng)速率與待測(cè)酶活性濃度成正比待測(cè)酶的最適pH與工具酶的最適pH接近在一系列工具酶反應(yīng)中，主要限速因子應(yīng)該是待測(cè)酶和待測(cè)化合物

方法條件的選擇

盡可能采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法；減少步驟,化學(xué)試劑有一定純度,雙蒸水,使用雙試劑。

測(cè)定參數(shù)的設(shè)置

方法類(lèi)型、波長(zhǎng)、樣品量與試劑量、稀釋水量、試劑吸光度上下限、空白速率、反應(yīng)孵育時(shí)間、延遲,監(jiān)測(cè)時(shí)間、底物耗盡限額、線性范圍及計(jì)算因子F值。

標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存

影響因素：溶血、抗凝劑、溫度等。

干擾因素的控制

反應(yīng)干擾；污染；底物自行發(fā)生反應(yīng)。(四)血清酶活性濃度測(cè)定條件的選擇

標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存溶血：細(xì)胞內(nèi)酶而言，細(xì)胞內(nèi)外濃度差異大；所以應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分離，靜脈采血后應(yīng)在1～2h內(nèi)分離血清?？鼓齽豪貌菟猁}、枸櫞酸鹽、EDTA抗凝的血漿一般不用作酶活性測(cè)定；肝素對(duì)ALT、AST、CK、LD、ACP檢測(cè)均無(wú)影響，可用于急診；臨床多用血清為首選測(cè)定標(biāo)本。溫度：大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清分離當(dāng)天測(cè)定，否則應(yīng)放冰箱冷藏；通常在0～4°C下使用、處理及保存，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學(xué)測(cè)定時(shí)血清標(biāo)本及質(zhì)控長(zhǎng)期保存的方法。慣用單位慣用單位是酶活性測(cè)定方法的建立者所規(guī)定的單位。由于單位定義不同，參考范圍差別很大，難以進(jìn)行比較。國(guó)際單位（IU）在特定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。以IU表示，1IU=1mol/min。Katal單位在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量為1kat，1kat=1mol/s。常用單位為katal或nkatal。Kat與IU的換算關(guān)系為：1IU=1mol/min=16.67nmol/s=16.67nkatal（六）酶活性濃度的單位

1.酶活性單位2.酶活性濃度單位

臨床上酶活性濃度采用每單位體積（升）所含的酶活性單位數(shù)表示。U/L酶活性濃度單位的計(jì)算連續(xù)監(jiān)測(cè)法根據(jù)摩爾吸光系數(shù)進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。公式如下：式中：V為反應(yīng)總體積;v為樣本體積;ε為摩爾吸光系數(shù);L為比色杯光徑(cm)上述公式可簡(jiǎn)化為：

如LD活性濃度，已知NADH的為6.22103·cm2.mol-1，血清量為50l，底物液為1ml，比色杯光徑為1cm，則

K=1.05106/6.221030.051=3376。

KK(七)、系數(shù)K值的計(jì)算及應(yīng)用系數(shù)K值的種類(lèi)理論K值實(shí)測(cè)K值理論K值K值根據(jù)下式計(jì)算，適用于儀器處于良好工作狀態(tài)的情形，波長(zhǎng)、溫度、光徑、加樣均沒(méi)有不可接受的誤差K實(shí)測(cè)K值當(dāng)儀器不理想的工作狀態(tài)，波長(zhǎng)、溫度、光徑、加樣等有不可接受的誤差時(shí)，使用高純度的底物或產(chǎn)物作為校正物，測(cè)定實(shí)際工作狀態(tài)下的克分子消光系數(shù)（ε’）,然后根據(jù)下面公式計(jì)算K’

K’

ε’

二、酶的質(zhì)量測(cè)定利用酶蛋白分子具有抗原性的特點(diǎn)，可以通過(guò)抗原抗體反應(yīng)的原理直接測(cè)定酶的質(zhì)量，報(bào)告方式用質(zhì)量濃度單位。如用免疫學(xué)方法測(cè)定CK-MB質(zhì)量，結(jié)果用ng/ml或ug/L報(bào)告。1.酶的免疫化學(xué)測(cè)定方法：

放射免疫測(cè)定（RIA）、免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CLIA）、酶免疫測(cè)定（EIA）、熒光酶免疫測(cè)定（FEIA）。2.免疫化學(xué)法的結(jié)果報(bào)告方式：（1）用酶活性濃度單位，結(jié)果以U/L表示。（2）用質(zhì)量濃度單位，結(jié)果直接用ng/ml或g/L表示。3.免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)：

①靈敏度高，能測(cè)定樣品中少量或痕量酶；

②特異性高，不受體液中其他物質(zhì)的影響；

③能測(cè)定一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白；

④特別適用于測(cè)定同工酶。4.免疫化學(xué)測(cè)定的局限性：

①制備足夠量的提純酶和抗血清非常困難且工作量大；

②測(cè)定步驟多，操作繁瑣；③測(cè)定成本高。方法同工酶(或亞型)的性質(zhì)差異同工酶、亞型電泳法電荷不同所有同工酶、亞型層析法(離子交換層析、親和層析)電荷不同CK，LD，ALP免疫分析法免疫抑制法特異性抗體反應(yīng)性不同CK、LD、ACP免疫化學(xué)測(cè)定法特異性抗體反應(yīng)性不同CK、LD、ACP、ALP、AMY動(dòng)力學(xué)分析法底物特異性分析法底物Km、親和力不同ACP、CK、LD（-羥丁酸）抑制劑分析法對(duì)小分子量的抑制劑的特異性抑制不同LD（草酸）、ACP（L-酒石酸）、ALP（L-苯丙氨酸）pH分析法最適pH不同AST熱失活分析法熱穩(wěn)定性不同ALP蛋白酶水解法對(duì)蛋白水解酶敏感度不同LD、AST三、同工酶檢測(cè)

（一）

電

泳

法

1.電泳材料：醋酸纖維素薄膜、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、等電聚焦及毛細(xì)管電泳等。2.區(qū)帶顯色：各同工酶區(qū)帶進(jìn)行酶促反應(yīng)，利用底物、產(chǎn)物及衍生物等的顏色變化或他們與染料結(jié)合后的顏色變化進(jìn)行檢測(cè)，采用光密度計(jì)或熒光計(jì)掃描定量，而顏色的深淺與同工酶活性成正比。3.巨分子酶產(chǎn)生的原因：

①酶與免疫球蛋白形成復(fù)合物，如CK-BB-IgG、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，如LD-β-脂蛋白等；③酶亞基或酶分子之間形成聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亞基自身聚合等。（二）層析法

1.層析法：利用同工酶分子量大小、所帶電荷多少的不同，以及受某些離子交換劑吸附的強(qiáng)弱程度不同來(lái)進(jìn)行分離鑒定的方法。2.常用的是柱層析，如離子交換層析和親和層析。3.因操作方法費(fèi)時(shí)繁瑣，一般不用于臨床同工酶常規(guī)檢測(cè)，而主要用于同工酶的分離、制備、純化。（三）免疫分析法

1．免疫抑制法根據(jù)同工酶的某一種亞基與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，而不含這種亞基的同工酶則不受影響，測(cè)定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化，即可算出該型同工酶的活性。2．免疫沉淀法該法利用分離提純的同工酶作為抗原制備的抗體與含該型同工酶的待測(cè)樣品混合，在一定條件下形成抗原抗體復(fù)合物沉淀，離心后測(cè)定上清液中其他型別的酶活性。利用加入抗體前測(cè)得的總酶活性減去上清液中的酶活性，即可算出被沉淀的同工酶的活性。3．其他免疫學(xué)方法測(cè)定酶蛋白利用酶是蛋白類(lèi)抗原但含量極微的特點(diǎn)，可應(yīng)用靈敏度較高的免疫電泳、RIA、EIA等方法。這類(lèi)方法的最大特點(diǎn)就是與酶活性無(wú)關(guān)，而是測(cè)定酶的質(zhì)量。（四）同工酶的其他分析方法

1．底物特異性分析法利用不同的同工酶對(duì)底物的Km及親和力的差異即可進(jìn)行分析。如人的LD1對(duì)-羥丁酸的親和力較大Km為0.84mmol/L，而LD5對(duì)-羥丁酸的親和力較小Km為10mmol/L。2．抑制劑分析法利用同工酶之間結(jié)構(gòu)的不同而對(duì)同一種抑制劑有不同的親和性和反應(yīng)性來(lái)進(jìn)行分析。3．pH分析法利用不同的同工酶可有不同的最適pH進(jìn)行分析。如AST的最適pH為7.4，當(dāng)pH降為6.5時(shí)，血漿AST（ASTs）活性明顯降低，而線粒體AST（ASTm）則仍保持活性。4．熱失活分析法利用不同同工酶的耐熱性不同來(lái)進(jìn)行分析與鑒定。如ALP同工酶對(duì)熱的反應(yīng)差異很大，胎盤(pán)ALP在70℃高溫下酶活性也無(wú)變化，而骨ALP在55℃10min活性則喪失過(guò)半。第三節(jié)常用酶及同工酶測(cè)定的臨床應(yīng)用

“血清酶”是指存在于血清中的酶，而非血清特定產(chǎn)生的。一、血清酶（一）血清酶的來(lái)源和去路

名稱(chēng)

血漿特異酶

非血漿特異酶

外分泌酶細(xì)胞酶一般代謝酶組織專(zhuān)一酶來(lái)源肝消化腺或其它外分泌腺

各組織器官（無(wú)器官專(zhuān)一性）肝（有器官專(zhuān)一性）

種類(lèi)凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纖溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK等

OCT等

1.血清酶的來(lái)源

2.血清酶的去路(1）血清酶的半壽期酶失活至原來(lái)活性一半時(shí)所需時(shí)間稱(chēng)為酶的半壽期。一般以半壽期來(lái)代表酶從血中清除的快慢。

血清酶甚至同工酶之間半壽期差別很大。這些有助于了解同一疾病不同酶升高持續(xù)時(shí)間的差異，半壽期長(zhǎng)的酶，在血清中持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。1．性別:多數(shù)血清酶的男女性別差異不大，但少數(shù)酶如CK、ALP及γ-GT等有性別差異，男性高于女性。

2．年齡:血清中有些酶的活性常隨年齡而變化。最明顯的一個(gè)

例子是ALP

3．進(jìn)食:血清中大多數(shù)酶不受進(jìn)食的影響，故測(cè)定酶活性不一

定需要空腹采血。高脂、高糖飲食后血清ALP活性升高。

4．運(yùn)動(dòng):激烈的肌肉運(yùn)動(dòng)可使血清中多種酶，如CK等活性升高。

5．妊娠:妊娠胎盤(pán)組織可分泌一些酶進(jìn)入母體血液，如耐熱ALP、LD等，引起血清中這些酶升高。

6．其他:血清中有些酶與同工酶有種族差異.(二)、血清酶的生理差異

血清酶的失活和排泄

研究表明酶主要是在血管內(nèi)失活或分解的，酶的清除與血漿蛋白的清除途徑并不完全相同。血清酶經(jīng)蛋白酶水解而產(chǎn)生的低分子多肽或氨基酸可經(jīng)小腸粘膜排至腸腔，再?gòu)氐追纸獬砂被岷笾匚?，其中大部分氨基酸可被組織利用，不能利用的氨基酸可經(jīng)尿排出體外。

(三)、血清酶變化的病理機(jī)制

正常情況下血清酶活性相對(duì)恒定。但在一些病理情況下，如細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞壞死；細(xì)胞內(nèi)酶合成增加；酶排泄障礙；惡性腫瘤異位分泌；酶合成障礙；中毒及遺傳缺陷等，常導(dǎo)致血清中酶活性的改變。(1)酶合成異常

1．合成減少肝損害時(shí)合成酶的能力受損，血清中相應(yīng)酶減少，慢性肝病時(shí)更為顯著。如肝病時(shí)因ChE、LCAT合成的減少而使血清中酶活性濃度降低；酶基因變異，也可引起酶合成減少，如肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病)患者，血中銅氧化酶可明顯下降。

2.合成增多

細(xì)胞對(duì)血清酶的合成增加或酶的誘導(dǎo)作用是血清酶活性升高的重要原因。增生性疾病如骨骼疾病時(shí)，可因成骨細(xì)胞增生，合成分泌更多的ALP而使血清中此酶升高。一部分惡性腫瘤患者血中酶升高有可能與腫瘤細(xì)胞中酶的合成增加有關(guān)，如前列腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生大量ACP。(2)酶釋放增加

酶從病變(或損傷)細(xì)胞中釋放增加是疾病時(shí)大多數(shù)血清酶增高的主要機(jī)制。研究表明，炎癥、缺血／缺氧、能源供應(yīng)缺乏、壞死和創(chuàng)傷等是細(xì)胞釋放大分子酶蛋白的重要原因。細(xì)胞酶的釋放量還受下述一些因素影響：1．細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異2．酶的相對(duì)分子量3．酶的組織分布4．酶在細(xì)胞內(nèi)的定位和存在形式(3)酶排出異常

約有24％的血清AMY由腎臟排出，腎功能減退時(shí)，血清AMY活性升高，可能因酶排泄障礙而在血液中滯留所致。膽道梗阻時(shí)，血清ALP升高的原因是梗阻區(qū)ALP合成加強(qiáng)，ALP排泄受阻而逆流人血。（三）血清酶的臨床應(yīng)用臨床上根據(jù)血清中酶濃度的改變可對(duì)疾病進(jìn)行輔助性診斷。

血清中酶濃度的改變常提示細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性增加，說(shuō)明機(jī)體的臟器或組織發(fā)生了損傷。若改變是由細(xì)胞內(nèi)酶的合成增加所引起，則表示組織有再生、修復(fù)、成骨或異位分泌，或有惡性腫瘤存在的可能；若改變是由酶的排泄障礙所導(dǎo)致，則說(shuō)明機(jī)體內(nèi)有梗阻的存在。

為了提高診斷的敏感度與特異性，常采用同時(shí)測(cè)定一組性質(zhì)不同的酶（“譜型”）

，比較其酶活性的變化，根據(jù)其酶活性增高或降低做出診斷。五、同工酶的診斷價(jià)值

(一)轉(zhuǎn)氨酶及其同工酶

生化特性丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙）：ALT(GPT)（天）門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草）：AST(GOT)

組織分布AST:主要分布于心、肝、骨胳肌、腎。同工酶：細(xì)胞質(zhì)ASTs；線粒體ASTm正常血清主要為ASTs，當(dāng)細(xì)胞受到輕度損傷時(shí)ASTs顯著升高。若血清中出現(xiàn)大量的ASTm，則表示細(xì)胞嚴(yán)重受損。ALT：主要分布于肝、腎、心、骨胳肌。有兩種同工酶：ALTs、ALTm，反映肝損傷靈敏指標(biāo).轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定方法

目前，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室多采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。ALT速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：AST速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：

轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定的臨床意義急性肝損害:ALT的升高常與病情輕重相平行，為判斷急性肝炎恢復(fù)的指標(biāo)。是肝壞死的前兆。心臟、骨骼肌等組織受損、肝膽疾病時(shí)血清ALT水平也可出現(xiàn)不同程度的升高。心肌、肝臟損傷血清AST會(huì)升高。腎臟或胰腺細(xì)胞損傷，血清AST也會(huì)升高。在AMI患者胸前區(qū)疼痛發(fā)作后6～8h，血清AST可明顯升高，發(fā)病后48～60h達(dá)峰值，4～5天可降至正常。轉(zhuǎn)氨酶輕度增加(1～3ULN)：胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、肉芽腫、腫瘤等。中度增加(3～10ULN)的疾?。簜魅拘粤馨驮龆喟Y、慢性活動(dòng)性肝炎、肝外膽道梗塞、心肌梗死等。重度增加(>20ULN)的疾?。翰《拘愿窝?、中毒性肝炎。

(二）肌酸激酶及其同工酶

生化特性由兩種不同亞基（M和B亞基）組成的二聚體。同工酶分：CK-BB（CK1）、CK-MB（CK2）、CK-MM（CK3）和CK–Mt(CK4)。組織分布

廣泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦組織。CK-BB在腦和脊髓內(nèi)含量最高稱(chēng)為腦型同工酶。

CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)稱(chēng)為心型同工酶。分為CK-MB1\CK-MB2亞型。骨骼肌中幾乎全部為CK-MM，稱(chēng)為肌型同工酶。分為CK-MM1\CK-MM2\CK-MM3亞型。CK的測(cè)定方法

酶偶聯(lián)法CK及其同工酶測(cè)定的臨床意義主要用于早期診斷AMI（1）血清CK總活力AMI后2～4h開(kāi)始升高，10～24h達(dá)峰值，3～4天恢復(fù)正常。（2）CK同工酶及亞型AMI胸痛發(fā)作后，血清CK-MB的上升先于其CK總活性，CK-MB/CK＞0.03可診斷為AMI。CK-MM亞型的測(cè)定：以CK-MM3/CK-MM1＞1.0作為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)。CK-MB2亞型：在AMI早期診斷和判斷有無(wú)再灌注上同樣有很高的靈敏度和特異性。一般以CK-MB2＞1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1＞1.5作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

（三）乳酸脫氫酶及其同工酶

生化特性

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的一種重要酶。LD除催化L-乳酸外還可催化α-羥丁酸、γ-酮丁酸進(jìn)行脫氫反應(yīng)。

組織分布

LD位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種糖酵解酶。LD是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體。5種同工酶(LD1,LD2,LD3,LD4,LD5)。

LD的測(cè)定方法目前多用連續(xù)監(jiān)測(cè)法。以乳酸為底物（反應(yīng)方向LP）的順向反應(yīng)（稱(chēng)LD-L法）。為IFCC參考方法（pH為9.4）。通過(guò)在340nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)NAD+還原成NADH吸光度的增加速率而計(jì)算LD活性。LD同工酶的測(cè)定方法

常用電泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以瓊脂糖凝膠電泳法更多用。一般成年人存在如下規(guī)律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5，部分正常兒童血中可見(jiàn)LD1＞LD2。LD及其同工酶測(cè)定的臨床意義心肌梗死LD心肌酶中升高最晚，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。急性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎和肝癌時(shí)，LD明顯升高。LD同工酶主要用于AMI和肝病的診斷AMI:LD1升高最為顯著，LD1/LD2＞1，視為診斷AMI的一個(gè)特異指標(biāo)。肝膽疾病:LD5升高常表示有肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞性黃疸時(shí)LD5＞LD4，阻塞性黃疽時(shí)LD4＞LD5。腫瘤:肝癌時(shí)可伴有LD4和LD5明顯增高；白血病、膠原病時(shí)以LD3、LD4增高為主。惡性貧血:

AMI時(shí)血清酶學(xué)變化

酶

開(kāi)始升高時(shí)間（h）

達(dá)峰值時(shí)間（h）恢復(fù)正常時(shí)間（h）

CK3～810～3672～96CK-MB3～612～2448～72

AST6～1224～48

3～5天

LD12～2448～72

10～12天

LD1

10～1248～7210～12天

（四）-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶

生化特性-GT或GGT是一種含巰基的線粒體酶。組織分布

分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。

血清中GGT主要來(lái)源于肝膽系統(tǒng)。GGT測(cè)定的臨床意義(1)膽道疾病膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻等升高明顯。(2)肝實(shí)質(zhì)疾病肝炎、脂肪肝、肝硬化時(shí)中度升高。慢性肝炎活動(dòng)期GGT多增高，非活動(dòng)期則多正常。原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌時(shí)不同程度的增高。(3)誘導(dǎo)作用對(duì)乙醇性中毒的判斷有一定的價(jià)值。長(zhǎng)期接受巴比妥類(lèi)藥物、含雌激素的避孕藥者升高。酶學(xué)指標(biāo)

肝臟疾病ALTASTGGTALP急性病毒性肝炎↑↑↑↑↑↑↑↑