第六章一般毒性36

第六章化學毒物的一般毒性作用

（commontoxicityofchemicalpoison)1【目的要求】掌握一般毒性作用的概念、試驗?zāi)康氖煜ひ话愣拘栽囼灧椒ㄒc熟悉亞慢性毒性試驗方法了解蓄積毒作用概念2【內(nèi)容】急性毒作用：概念、試驗?zāi)康?、試驗方法的要點、分級和評價蓄積毒作用：概念亞慢性毒作用：概念、目的和方法要點慢性毒作用：概念、目的、方法要點和注意事項3毒理學主要三大研究領(lǐng)域描述毒理學（Descriptivetoxicology）機制毒理學（Mechanistictoxicology）管理毒理學（Regulatorytoxicology）

4毒理學研究方法整體動物試驗(invivo)體外試驗（invitro)人體觀察（HumanToxicology)流行病學研究(EpidemiologicalStudy)一般毒性試驗特殊毒性試驗急性亞急性亞慢性慢性皮膚和眼刺激性致敏性等致突變致畸致癌發(fā)育與生殖毒性離體器官：心、肝、肺、腎、腦細胞：原代細胞、細胞株、細胞系細胞器：線粒體、微粒體、胞核臨床毒理學研究：中毒事故的處理或治療志愿者研究：低濃度、短時間、可逆性描述流行病學研究：提出病因假說分析流行病學研究：驗證病因假說，明確因果關(guān)系5外源化學物的一般毒性作用一般毒性作用也稱基礎(chǔ)毒性，是全身各系統(tǒng)對外源化學物的毒作用反應(yīng)，與特殊毒性（致畸、致突變、致癌）相對而言。6根據(jù)接觸毒物的時間長短，一般毒性作用分為急性毒性重復(fù)劑量毒性（亞急）亞慢性毒性慢性毒性根據(jù)毒物接觸時間長短所進行的觀察和評價毒效應(yīng)的試驗分為急性毒性試驗重復(fù)劑量毒性試驗亞慢性毒性試驗慢性毒性試驗7能夠進入人類生態(tài)環(huán)境和人密切接觸的物質(zhì)，特別是新化學物，均需對其進行一般毒性作用的觀察和評價。包括新的食品、藥品、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)化學品（消毒劑）等。8化學毒物一般毒性作用的研究對防治外源化學物所致急慢性中毒，對毒理學安全性評價和危險度評定，制訂衛(wèi)生標準以及管理毒理學的決策方面均具有十分重要的意義。9第一節(jié)急性毒性作用

（acutetoxicity)10一般毒性評價方法以哺乳動物體內(nèi)試驗為主。急性毒性作用是毒理學研究中最基礎(chǔ)的工作，是了解外源化學物對機體產(chǎn)生急性毒性的主要依據(jù)，急性毒性試驗是毒理學安全性評價的第一步。在不同類型化學品的法規(guī)程序中通常是必做試驗。11急性毒性：是指機體(人或?qū)嶒瀯游?一次或24小時內(nèi)多次接觸外源化學物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)包括一般行為、外觀改變、大體改變及死亡效應(yīng)，最主要觀察指標是LD50

一、急性毒性的概念12中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時間：化學物使實驗動物發(fā)生中毒效應(yīng)的快慢和劇烈的程度，可因所接觸的化學物的質(zhì)與量不同而異有的化學物在實驗動物接觸致死劑量的幾分鐘之內(nèi)，就可發(fā)生中毒癥狀，甚至死亡而有的化學物則在幾天后才顯現(xiàn)中毒癥狀和死亡，即遲發(fā)死亡13二、急性毒性試驗的目的1.測試和求出受試化學物的致死劑量(通常以LD50為主要參數(shù))，并對該外源化學物進行急性毒性分級142.通過觀察動物中毒作用表現(xiàn)、毒作用強度和死亡情況，初步評價毒物對機體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量－反應(yīng)關(guān)系和對人體產(chǎn)生損害的危險性3.為后續(xù)的重復(fù)劑量、亞慢性及慢性毒性試驗研究以及其他毒理試驗提供接觸劑量和觀察指標選擇的依據(jù)154.為毒作用機理研究提供線索，了解中毒效應(yīng)的特征（包括癥狀的，生理的，生化與組織病理損傷）5.研究化學物急性中毒診斷、預(yù)防和急救治療措施16三、經(jīng)典的急性毒性試驗方法要點

實驗動物染毒途徑染毒劑量觀察周期觀察指標的選擇計算方法和評價經(jīng)典的急性毒性試驗以死亡為其觀察終點，如概率單位法、改進寇氏法和霍恩法17盡量選擇對化合物毒性反應(yīng)與人近似的動物；易于飼養(yǎng)管理，試驗操作方便；繁殖生育力較強，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)；易于獲得、品系純化，且價格較低的動物。為了有利于預(yù)測化合物對人的危害，要求選擇兩種以上的實驗動物，最好一種為嚙齒類，一種為非嚙齒類，分別求出其急性毒性參數(shù)。在幾種常用的哺乳動物中，大鼠為首選的嚙齒類動物。(一)實驗動物選擇181.實驗動物的選擇研究內(nèi)容實驗動物急性毒性免疫毒性放射病吸入性粉塵藥物對皮膚局部作用實質(zhì)性臟器的毒作用遲發(fā)性神經(jīng)毒慢性毒性致畸性致突變性、致癌性大、小鼠大、小鼠、最常用C57BL/6狗、大、小鼠，不宜用兔大鼠家兔、豚鼠小鼠來亨雞大鼠、狗大、小鼠、家兔大、小鼠19昆明小鼠NIH小鼠ICR小鼠BALB/c小鼠BALB/c-nu裸小鼠20金黃倉鼠豚鼠Wistar大鼠21新西蘭兔Beagle犬來亨雞巴馬香豬22恒河猴23動物種類成年體重選擇范圍(g)生活年限(年)時間（月）體重(g)急性試驗慢性試驗小鼠1.5～221518～2510～15大鼠2～2.53150180～24050～100豚鼠6～83250200～250150～200兔4～93～415002000～25001200～1500貓10～123～415001500～25001000～1500狗15～203～4100008000～150004000～80002.實驗動物的生活年限及體重選擇243.性別急性毒性試驗所用的動物應(yīng)當是雌、雄各半如果在研究中發(fā)現(xiàn)待測化學物對雌、雄動物的毒性大小有明顯差異時，應(yīng)分別求出雌性與雄性動物各自的LD50值如果試驗是為致畸試驗作劑量準備，也可僅做雌性動物的LD50試驗25在利用不同的方法測定化學物LD50時，實驗設(shè)計中對動物數(shù)的要求不同4．實驗動物分組和數(shù)量霍恩氏法測LD50時要求有4個劑量組，每組5只動物，雌雄各半

26概率單位法、Bliss法測定則要求5—7個劑量組，每組10只動物或10只以上

對于不同的化學物測定應(yīng)根據(jù)其相應(yīng)的試驗規(guī)程確定實驗動物數(shù)量27動物分組：均衡性和隨機性均衡性：要求各組動物的平均體重及體重的離散度盡可能一致。具體來說是（1）實驗動物的體重不應(yīng)超過全體實驗動物平均體重的20％---控制離散度（2）每組之間的平均體重相差不應(yīng)超過10％---控制均衡性285.實驗動物的預(yù)檢：適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，選擇健康的動物適應(yīng)環(huán)境篩檢動物隨機性：（隨機分組）每只動物分散到各組去的機會是均等的，以避免成見或系統(tǒng)誤差29實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境：實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在223℃，家兔可控制在203℃，相對濕度30%～73%，無對流風。每籠動物數(shù)以不干擾動物個體活動及不影響試驗觀察為度，必要時需單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室采用人工晝夜為好，早6點至晚6點進行12小時光照，其余12小時黑暗，一般食用常規(guī)試驗室飼料，自由飲水。306.給藥前禁食處理凡經(jīng)口染毒時，要求試驗前要對動物禁食，以保證胃內(nèi)無食物，減少食物對化學物毒性的干擾禁食時間:隔夜禁食禁食不禁水經(jīng)口多次可不禁食31

(二)受試物及處理受試物的接受、分樣、保管、稱重、配制以及在此過程中嚴格的質(zhì)量保證影響急性毒性試驗受試物的化學結(jié)構(gòu)、純度、雜質(zhì)、理化性質(zhì)特別是揮發(fā)、溶解性等。受試物一般應(yīng)臨用前新鮮配制，除非已證明溶液貯存是穩(wěn)定的。

受試物劑型：水溶液、混懸液、油溶液32

(三)染毒方法模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸該受試物的途徑和方式工業(yè)化學毒物：經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮農(nóng)用化學物：經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道藥品：經(jīng)口、經(jīng)注射食品：經(jīng)口環(huán)境污染物：經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮吸收速率：靜脈注射>吸入>肌注>腹注>皮下注射>經(jīng)口>皮內(nèi)注射>經(jīng)皮331.經(jīng)口(胃腸道)染毒(灌胃，喂食，膠囊）（1）灌胃（等容量灌胃法）狗的灌胃3435空腹灌胃后2-3h復(fù)食灌胃的體積不超過體重的1-2％：小鼠為0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g較合適

大鼠為5ml/只(通常用0.51.0ml/100g）

家兔為10ml/2kg體重，狗不超過50ml/10kg362.經(jīng)呼吸道接觸在常溫、常壓下為氣態(tài)，或在生產(chǎn)過程中和生活過程中以蒸氣、氣溶膠、煙、粉塵狀態(tài)污染生產(chǎn)與生活環(huán)境空氣，此時就有可能經(jīng)呼吸道吸入靜式吸入：將動物置于一定體積的密閉容器內(nèi)，加入定量的易揮發(fā)的液態(tài)化合物或一定體積的氣態(tài)化合物，在容器內(nèi)形成所需要的受試化合物濃度的空氣環(huán)境。

動式吸入：動物處于空氣流動的染毒柜中，染毒柜裝置備有新鮮空氣補入與含受試化合物空氣排出的動力系統(tǒng)和隨時補充受試化合物的配氣系統(tǒng)。373.經(jīng)皮膚染毒

研究外源化學物經(jīng)皮膚吸收應(yīng)當盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象，目前多選用家兔和豚鼠但由于研究化學物經(jīng)皮膚吸收的毒性(求經(jīng)皮LD50)所需的實驗動物較多，使用家兔、豚鼠不夠經(jīng)濟，也常用大鼠代替38經(jīng)皮膚染毒程序給予受試物前24h，確定受試部位機械或化學脫毛面積10%～15%體表面積檢查去毛部位有無異常現(xiàn)象單位體重相同容積染毒，接觸時間與人實際接觸該化學物的時間相仿394.經(jīng)注射染毒常用實驗動物給予受試物的體積(ml)注射方式小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2～1.01～32～55～105～15肌肉0.1～0.20.2～0.50.2～0.50.5～12～5靜脈0.2～0.51～21～53～105～15皮下0.1～0.50.5～10.5～21～33～1040外源化學物LD50時設(shè)置幾個劑量組較為合適，應(yīng)依預(yù)試驗結(jié)果而定一般設(shè)置57個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只最大劑量法：以最大容積最高濃度給予動物后未見死亡，可不進一步試驗求出LD50值。41（五）毒性作用觀察1.中毒體癥和發(fā)生過程觀察（P123）很多化學物在實驗動物接觸的初期往往先出現(xiàn)興奮現(xiàn)象，有的化學物在動物接觸的初期首先表現(xiàn)為抑制現(xiàn)象

通過毒性表現(xiàn)可初步確定急性毒性靶器官422.死亡情況和時間分布：計算LD503.體重：在觀察期間應(yīng)注意觀察其體重變化。這有助于了解受試化學物所致的中毒效應(yīng)是短暫的或較長期的效應(yīng)434.病理檢查和其它指標觀察應(yīng)當重視病理組織學檢查凡中毒死亡動物應(yīng)及時解剖做病理學檢查，檢查器官有無充血、出血、水腫或其它改變，并對有變化的臟器作病理組織學檢查對存活動物于觀察期結(jié)束后應(yīng)做病理學檢查

44(六)觀察時間和周期

測定外源化學物的LD50(LC50)，一般要求計算實驗動物接觸化學物之后兩周（14天）內(nèi)的總死亡數(shù)對于一些速死性化學物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率45四、急性毒性分級和評價急性毒性試驗主要目的之一是對化學物的急性毒性進行分級，評價化學物的急性毒性強弱，用于比較其急性毒性大小。WHO于2003年公布《全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度》（GHS），2005年修訂，2008年GHS將全面實施。GHS對急性毒性分級以LD50/LC50值為依據(jù)劃分。46WHO急性毒性分級毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50（mg/kg）劇毒<1高毒1~中等毒50~低毒500~實際無毒5000~47五、急性毒性替代試驗固定劑量法Fixeddoseprocedure不以動物死亡作為觀察終點急性毒性分級法Acutetoxicclassmethod以死亡為終點的分階段試驗法上-下移動法Up/downmethod以死亡為終點但也可用于觀察不同的終點48第二節(jié)局部刺激試驗49局部刺激試驗（localirritationtest)目的是了解外源化學物對皮膚、眼睛的局部刺激性和腐蝕性，包括眼刺激、皮膚刺激試驗。試驗結(jié)果可為制定化學物對眼睛和皮膚防護措施提供依據(jù)。我國農(nóng)藥、化妝品和消毒劑毒理學試驗程序均規(guī)定局部刺激試驗為必做項目。局部刺激試驗50一、眼刺激試驗眼原發(fā)性刺激試驗觀察終點為眼刺激和眼腐蝕。眼刺激試驗推薦方法是Draize試驗。使用家兔4只，滴眼后觀察結(jié)膜、角膜和虹膜的反應(yīng)，按規(guī)定的分級標準進行評分，一般觀察期為7天。51二、皮膚原發(fā)性刺激試驗皮膚原發(fā)性刺激試驗包括單次和多次皮膚刺激試驗，完整皮膚和破損皮膚刺激試驗等。觀察終點為皮膚刺激和皮膚腐蝕。皮膚刺激評價方法稱Draize試驗。皮膚刺激試驗常用動物為家兔和豚鼠。在不同時間里觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，皮膚反應(yīng)的表現(xiàn)為紅斑，損傷最重的可形成焦痂，一般按紅斑和水腫的嚴重程度評分。觀察時間的長短應(yīng)足以觀察到可逆或不可逆刺激作用，一般不超過14天。52三、皮膚致敏試驗皮膚致敏：又稱致敏性接觸性皮炎，是一種化學物免疫介導(dǎo)的皮膚反應(yīng)，人體反應(yīng)的特點為瘙癢、紅斑、水腫、丘疹、水皰等。皮膚致敏試驗的目的是通過動物試驗預(yù)測化學品經(jīng)皮膚接觸對人類引起皮膚致敏反應(yīng)的危害。53皮膚第一次接觸外源化學物產(chǎn)生較輕的反應(yīng)或無明顯反應(yīng)，經(jīng)過一段時間（幾周或幾年）再次接觸，會引起遲發(fā)性超敏反應(yīng)（接觸性皮炎），且在最初染毒部位以外的皮膚均可發(fā)生。皮膚超敏反應(yīng)試驗常選擇豚鼠，試驗分誘導(dǎo)接觸（inductionexposure)和激發(fā)接觸（challengeexposure）。54誘導(dǎo)接觸是以較低或中等濃度受試物對皮膚重復(fù)染毒（涂皮或皮下注射），一般需14天。間隔10-14天后，到激發(fā)階段，用激發(fā)劑量（低于誘導(dǎo)劑量）受試物未染過毒的皮膚部位，觀察24、48和72小時后有無皮膚反應(yīng)，以皮膚反應(yīng)的嚴重程度來評分。55第三節(jié)短期、亞慢性

和慢性毒性作用56人類接觸化學物的方式往往是長期的、重復(fù)的、低水平的，不會發(fā)生急性毒作用。長期重復(fù)劑量染毒和一次劑量染毒所致毒作用可能完全不同，因此，用急性毒性資料難以預(yù)測慢性毒性。重復(fù)劑量毒性試驗（亞急性）亞慢性毒性試驗慢性毒性試驗一、概述57蓄積作用（accumulation)：外源化學物連續(xù)地、反復(fù)地進入機體，而且吸收速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時，化學物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留的現(xiàn)象。（一）、蓄積作用58蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)一種外源化學物有無蓄積作用是評定該化學物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標準時安全系數(shù)的一種依據(jù)59物質(zhì)蓄積（materialaccumulation)：實驗動物反復(fù)多次接觸化學物后，用化學分析方法能夠測得機體內(nèi)存在該化學物或其代謝產(chǎn)物功能(機能)蓄積（functionalaccumulation)：有的化學物在長期接觸后，機體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用60（二）短期重復(fù)劑量毒性作用、亞慢性毒性和慢性毒性作用的基本概念短期重復(fù)劑量毒性是指實驗動物或人連續(xù)接觸外源化學物14-30天所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。亞慢性毒性（subchronictoxicity）是指實驗動物或人連續(xù)較長期（相當于生命周期的1/10）接觸外源化學物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。慢性毒性（chronictoxicity）是指實驗動物長期染毒外源化學物所引起的毒性效應(yīng)。61短期重復(fù)劑量毒性試驗、亞慢性毒性和

慢性毒性作用的目的1.觀察長期接觸受試物的毒性效應(yīng)譜，毒作用特點和靶器官。了解其毒性機制。2.研究重復(fù)接觸受試物的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL），為制定人類接觸的安全限量參考數(shù)值3.觀察長期接觸受試物毒性作用的可逆性。4.確定不同動物對受試物的毒效應(yīng)的差異，為將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)62二、研究方法重復(fù)劑量毒性試驗、亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗在設(shè)計和評價上有許多共同之處，亞慢性毒性試驗是長期重復(fù)試驗中最常用的，以該試驗為重點介紹其研究方法。631、實驗動物的選擇亞慢性毒性作用研究一般要求選擇兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類，如大鼠(Wistar,Sprague-Dawley)和狗（Beagle犬），以便全面了解受試物的毒性特征64由于亞慢性毒性試驗期較長，所以選擇被動物的體重(年齡)應(yīng)較?。x乳不久動物），如小鼠應(yīng)為15g左右，大鼠100g左右65實驗動物分四級：普通動物（Conventionalanimal,CV）、清潔動物（Cleananimal,CLorCleanconventionalanimal，CCV）無特定病原體動物（Specificpathogenfreeanimal,SPF）、無菌動物（Germfreeanimal,GF），亞慢性毒性試驗應(yīng)使用清潔級以上動物，并在屏障環(huán)境內(nèi)進行試驗

66GLP動物實驗平臺672、染毒途徑亞慢性毒性試驗接觸外源化學物途徑的選擇，應(yīng)考慮兩點：

1.盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式

2.應(yīng)與預(yù)期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致具體接觸途徑主要有經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種68亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應(yīng)，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。此劑量的確定可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；二是以此化合物LD50的1/201/5為最高劑量。3.劑量選擇與分組694.觀察指標

（1）一般性指標1）外觀體征、行為活動：（時間順序）2）動物體重：體重變化的表示方式，可將接觸組與對照組同期體重絕對增長的重量或體重百分增長率(以接觸化學物開始時動物體重為100%)進行統(tǒng)計和比較703）食物利用率：是指動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)。分析比較接觸組與對照組食物利用率，有助于分析受試化學物對實驗動物的生物學效應(yīng)4）癥狀實驗動物在接觸外來化合物過程中所出現(xiàn)的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間均應(yīng)記錄和分析71血液學指標：包括紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)和分類、血紅蛋白定量、血小板等血液生化指標：AST、ALT、ALP（堿性磷酸酶）、BUN、TP、ALB、GLU、T-BIL（膽紅素）、Crea、T-CHO一般為篩檢性和探討性（2）實驗室檢查：72亞慢毒性試驗中應(yīng)重視病理學檢查。凡是在染毒過程中死亡的動物均應(yīng)及時解剖，肉眼檢查后再進行病理組織學檢查。必要時作組織化學或電鏡鏡檢

(3)系統(tǒng)尸檢和病理學檢查731）臟器系數(shù)(稱臟/體比值)：是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g體重計。如肝/體比即(全肝濕重/體重)100此指標的意義是實驗動物在不同年齡期，其各臟器與體重之間重量比值有一定規(guī)律若受試化學物使某個臟器受到損害，則此比值就會發(fā)生改變，可以增大或縮小，如增生、充血、水腫、萎縮等變化。74因此，臟/體比值是一個靈敏、有效和經(jīng)濟的指標2）病理學檢查：組織病理學檢查是亞慢性毒性試驗中最重要的檢測指標之一。可確定化學物對機體毒作用的靶部位、損害的性質(zhì)和程度。

（4）其它檢查：生物標志物75三、慢性毒性作用（chronictoxicity)慢性毒性：是指實驗動物或人長期（甚至終生）反復(fù)接觸外源化學物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)76慢性毒性試驗的試驗期限，應(yīng)依受試物的具體要求和實驗動物的物種而定如用大鼠試驗期限可為1年，用狗則試驗期限可1～2年慢性毒性試驗應(yīng)終生接觸受試物如果慢性毒性試驗與致癌試驗結(jié)合進行，則實驗動物染毒時間最好接近或等于動物的預(yù)期壽命77（三）慢性毒性試驗方法要點

1、實驗動物的選擇慢性毒性試驗選擇實驗動物的條件與亞慢性毒性試驗相同。但實驗動物最好為純系甚至同窩動物均勻分布于各劑量組78實驗動物年齡應(yīng)較小，大鼠和小鼠應(yīng)為初斷奶者，即小鼠出生后3周，體重1012g；大鼠出生后34周，體重50