實驗六 醋酸纖維薄膜電泳法分離血清

實驗六

醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白

實驗目的掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理；掌握血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳的操作方法。1.電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離。2.影響電泳遷移率的因素：

內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀

外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象實驗原理3.血清中各種蛋白質(zhì)的等電點在pH4.0～7.3之間，在pH8.6的緩沖溶液中均帶負電荷，在電場中向正極泳動。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，所以帶電荷量也不同。此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異，因此在同一電場中泳動的速度不同。分子小而帶電荷多者，泳動較快；反之，則較慢。4.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點。現(xiàn)已廣泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。5.經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。6、在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與結(jié)合的染料量成正比，故可將各蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4M氫氧化鈉溶液浸洗下來進行比色，測定其相對含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計掃描，測定其相對含量。實驗器材1.電泳儀：為電泳提供直流電源。2.電泳槽：為電泳提供場所。3.血清加樣器：可用蓋玻片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜：2cm×8cm5.其它：培養(yǎng)皿（直徑9-10cm）、濾紙、剪刀、鑷子等。實驗材料和試劑材料：牛血清試劑：1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液4、浸出液：0.4M氫氧化鈉溶液5、透明液：冰乙酸25ml，無水乙醇75ml，混勻即可。實驗操作1.

電泳槽的準備

電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。點好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上。2.醋酸纖維素薄膜的潤濕

將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中約30min后，用鑷子小心夾住薄膜一端，放在折疊的濾紙中，并用濾紙吸干表面液體。3.點樣把膜條鋪在玻璃板上（無光澤面朝上），將點樣器在血清中沾一下（量薄薄一層為好），再在膜條一端1.5-2cm處輕輕水平地落下并隨即提起，這樣即在膜條上點上了細條狀的血清樣品。此步是實驗的關(guān)鍵。4.電泳將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度0.3mA/cm膜寬度電泳時間約為1h。電泳后，關(guān)閉電泳儀切斷電源。5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5-10min。（染色液回收）6.漂洗：將薄膜從染色液中取出,自來水下沖洗除去多余的染色液后放入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中漂洗，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。正常血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖

1．為清蛋白，2，3，4，5，分別為α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6為點樣原點7、定量（1）剪下薄膜上各條蛋白質(zhì)色帶，另取一條與各區(qū)帶近似寬度的無蛋白附著的空白薄膜，分別浸于4ml0.4M氫氧化鈉溶液中，37℃水浴10min，色澤浸出后，用722分光光度計在590nm處比色，以空白膜條洗出液為空白調(diào)零，測定各管的吸光度。設(shè)各部分吸光度分別為：A白、Aa1、Aa2、Aβ、Aγ，A總=A白+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ蛋白含量（100%）=A/A總X100%（2）待薄膜完全干燥后，浸入透明液中約10-20min，取出，平貼于干凈玻璃片上，干燥，即得背景透明的電泳圖譜，可用光密度計測定各蛋白斑點。此圖譜可長期保存。注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。5、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，