瓊脂糖凝膠電泳和SDSPAGE凝膠電泳2

DNA/RNA的瓊脂糖凝膠檢測2023/2/612015/5/6凝膠電泳分離長度瓊脂糖凝膠電泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝膠電泳5—500bp分辨率高采用不同濃度的凝膠可以分辨DNA分子的范圍2023/2/622015/5/6一、實驗原理

電泳是現(xiàn)在用于分離和純化DNA/RNA片段的最常用技術(shù)。當(dāng)制備好的一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)并把它置于靜電場中，DNA/RNA分子將向陽極移動，這是因為DNA/RNA分子沿其雙螺旋骨架兩側(cè)帶有富含負(fù)電荷的磷酸根殘基。當(dāng)DNA/RNA長度增加時，來自凝膠的阻力就會增加，不同長度的DNA/RNA片段就會出現(xiàn)不同的遷移率。因而就可依據(jù)DNA/RNA分子的大小使其分離2023/2/632015/5/6含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍

凝膠中的瓊脂糖含量%(W/V)DNA/RNA分子的分離范圍(kb)0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—22023/2/642015/5/6核酸染料

溴化乙錠（EB）是一種為芳香族類染料，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測瓊脂糖中的DNA。Godview吖啶橙類核酸低毒染料目前尚未發(fā)現(xiàn)具有致癌性。Genegreen花青素母體為基礎(chǔ)，苯環(huán)改良成鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)的油性大分子，目前認(rèn)為的最低毒的核酸綠色染料。備注：一般將核酸染料加入loadingbuffer中可以減少污染及減少用量（1mlloadingbuffer：10ul染料）。2023/2/652015/5/6電泳緩沖液的組成

Tris—乙酸（TAE）Tris—硼酸（TBE）Tris—磷酸（TPE）其濃度約為50mmoL/L，PH為7.5—7.8,這些緩沖液均含有EDTA。這些緩沖液通常配制成濃縮液，貯存于室溫。2023/2/662015/5/6常用的電泳緩沖液的配制緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris—乙酸（TAE）1×：0.04moL/LTris—乙酸

0.001moL/LEDTA50×：242gTris堿57.7mL冰乙酸100mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—磷酸（TPE）1×：0.09moL/LTris—磷酸

0.002moL/LEDTA10×：108gTris堿15.5mL85%磷酸40mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—硼酸（TBE）0.5×0.045moL/LTris—硼酸

0.001moL/LEDTA5×：54gTris堿27.5g硼酸20mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)2023/2/672015/5/6加樣緩沖液

緩沖液類型

6×緩沖液貯存溫度I

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液4℃II

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖水溶液室溫III

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4℃IV

0.25%溴酚藍(lán)

40%（W/V蔗糖水溶液）4℃V（堿性加樣緩沖液）

300mmoL/LNaoH6mmoL/LEDTA18%聚蔗糖水溶液

0．15%溴甲酚綠

0．25%二甲苯青FF4℃2023/2/682015/5/6加樣緩沖液可以增大樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)，還可以使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍,溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動的速率約與長300bp的雙鏈線性DNA相同,而二甲苯青FF在瓊脂糖凝膠中移動的速率則與4kb雙鏈線性DNA相同。2023/2/692015/5/6DNA片段長度標(biāo)記

DNA片段長度標(biāo)記通常叫作DNAMarker,本實驗使用MarkerIII，分別由200bp、500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp和4500bp的7條DNA條帶組成，DNAMarker不僅可以作為凝膠中DNA片段長度的一個標(biāo)記，還可以作為電泳的對照。2023/2/6102015/5/6二、實驗方法

1、50×TAE的稀釋：如制備50mL1×TAE，取1mL50×TAE加入49mL水定容至50mL。2、制備1%的瓊脂糖膠液：取0.2g瓊脂糖溶于20mLTAE中，在短時間里加熱瓊脂糖全部熔化，使溶液冷卻至60℃。2023/2/6112015/5/62023/2/6122015/5/63、用于RNA電泳的電泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥后灌滿3%的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用DEPC—SDW沖洗電泳槽，梳子同樣處理。4、在制膠槽中放好梳子。將融化的瓊脂糖凝膠導(dǎo)入膠槽中。室溫冷卻15-20min5、將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在3—5mm之間，凝固15—20min。基本參數(shù)（北京六一）：

外型尺寸（L×W×H）：310×150×90mm

凝膠板規(guī)格(L×W)：60×60mm；120×60mm；60×120mm；120×120mm

試樣格：11+25齒(1.0mm厚)；6+13齒,8+18齒(1.5mm厚)；2+3齒(2.0mm厚)

緩沖液總?cè)萘浚杭s650ml

重量：1Kg2023/2/6132015/5/66、在凝膠完全凝固之后，小心垂直移去梳子，將膠床放在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。7、向電泳槽中注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。8、分別將DNA/RNA樣品與加樣緩沖液混合,用移液槍將樣品加入加樣孔。9、正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為140V，電流一般為50mA。10、電泳結(jié)束后，在紫外觀測儀上進(jìn)行觀察。2023/2/6142015/5/6三、注意事項與實驗技巧制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生。紫外光對人眼有害，觀察時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長。EB具有強誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。加樣時，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA帶型不整齊。配膠和灌電泳槽需使用同一批緩沖液。因為pH或離子強度很小的差別也會在凝膠前部造成紊亂，影響DNA片段的泳動。梳板的選用一般每個制膠模具均配有多個齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點樣容積較大，用于DNA片段回收實驗等；相反，梳齒窄而薄，形成的點樣容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。一般來說，上樣量小時盡量選擇薄的梳板制膠，此時電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。

2023/2/6152015/5/6四、跑出好看的電泳圖凝膠一定要加熱熔解完全，均勻，可以對著光亮的地方看看清澈不清澈；一般情況下，梳子越薄而長，條帶越好看；上樣量不宜過多，會造成條帶的相互擠壓；如果點樣孔多余，將樣點到中間，盡量避免邊緣效應(yīng)，中間電場比較均勻；做膠的緩沖液和跑膠的緩沖液濃度應(yīng)該一致；加樣時不要太快，讓其自然沉底，均勻分布在電泳孔內(nèi)；電泳開始時可以采用低電壓使其跑出孔后，再調(diào)高電壓。

2023/2/6162015/5/6SDS凝膠電泳實驗二2023/2/617SDS凝膠電泳實驗原理實驗步驟注意事項SDS的優(yōu)點SDS的缺點實驗常見問題及處理小技巧2023/2/618實驗原理基本原理分類分離范圍2023/2/619丙烯酰胺N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺四甲基乙二胺(TEMED)過硫酸胺(AP)激活作用激活作用共聚合2023/2/620基本原理之一陰離子去污劑SDS破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。強還原劑巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵使這種結(jié)合更加充分。2023/2/621基本原理之二結(jié)合了SDS的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物其橢圓棒的短軸長度恒定，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電場作用下，其遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根據(jù)這一特點，就可以將各蛋白組分按分子量大小分開。2023/2/622分類

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類.

連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。2023/2/623電泳槽2023/2/624不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。2023/2/625濃縮膠濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。分離膠孔徑較小,通過選擇合適的凝膠濃度,可以使樣品很好的分離.2023/2/626SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，并形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20

時孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”為1：29配制，試驗表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。分離范圍2023/2/627變性膠濃縮膠10%8ml5%4ml(2cm)H2O3.2mlH2O3.2ml30%丙烯酰胺2.7ml30%丙烯酰胺0.67ml1.5MTrisHClPH8.82ml1MTrisHClPH8.81ml10%SDS100μl10%SDS50μl10%AP50μl10%AP25μlTEMED5μlTEMED5μl2023/2/628活性膠6%8mlH2O4.2ml30%丙烯酰胺1.67ml1.5MTrisHClPH8.82.02ml10%AP100μlTEMED10μl膠的配制方法凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212雙丙烯酰胺～丙烯酰胺摩爾比為1：29。2023/2/629上樣緩沖液之一

上樣緩沖液(SDS

loading

buffer)是一種以溴酚藍(lán)為染料，5倍濃縮的SDS凝膠電泳上樣緩沖液，用于常規(guī)的SDS蛋白電泳樣品上樣。

本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和使用時請務(wù)必注明，仔細(xì)區(qū)分。

2023/2/630上樣緩沖液

之二注意事項

還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT（二硫蘇糖醇）或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分；

含巰基的試劑有一定的毒性，為了安全和健康，應(yīng)穿實驗服并戴一次性手套操作。2023/2/631上樣緩沖液

之三使用說明

1.按每4μl蛋白樣品加入1μl蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。

2.

100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。

3.

冷卻到室溫后取上清直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。

4.

通常電泳時染料到達(dá)膠的底端附近（0.5～1cm)即可停止電泳。2023/2/632

增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴(kuò)散出來到電泳緩沖液中。

指示劑檢測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿。上樣緩沖液

之四2023/2/633

單純的固定液一般難以達(dá)到這些要求，因此在實驗中使用兩種混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15min至24h，冰箱、室溫均可。甲醇/冰醋酸固定液2023/2/634甲醇/冰醋酸固定液甲醇：有固定、硬化和脫水的作用?？梢怨潭ò椎鞍?、球蛋白、核蛋白，但對核蛋白固定效果較差(親和力小且易自溶)。甲醇固定的特點是殺死快，滲透力強，對組織收縮較大(可收縮20左右)，可使材料變硬。冰醋酸：純醋酸在溫度稍變低時即形成冰晶，所以又稱為冰醋酸。常用0.3～0.5的濃度作為固定液。冰醋酸對材料有膨脹作用，對核蛋白固定好，可與水、酒精、氯仿混合。2023/2/635電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后的凝膠照片圖1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測樣品電泳圖譜

940006200043000310002010014400注：膠槽1標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3樣品蛋白

考馬斯亮藍(lán)染色常用染色方法銀染法金屬離子染色法以考馬斯亮藍(lán)染色為例蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1000μg／mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。2023/2/636實驗步驟１．試劑配制

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中。4℃，1～2月

（2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉）

（3）1.5mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.9)：

稱取Tris18.2g,加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8,最后用蒸餾水定容至100ml。2023/2/637（4）1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8):

稱取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,最后用蒸餾水定容至100ml（5）0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)：稱取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0,最后用蒸餾水定容至100ml（６）TEMED（四甲基乙二胺）2023/2/638（７）上樣緩沖液：

SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml（８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻（９）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R2500.125g，加上述固定液250ml，過濾后備用2023/2/639（1０）脫色液：

冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml（1１）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml2023/2/640（12）高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒:

兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

置-20℃保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。（13）樣品：兔血清2023/2/641２.聚膠前準(zhǔn)備

(1)配制10％過硫酸銨溶液(需每天新鮮配制)。

(2)將單體儲存液、緩沖液、水按照一定比例配制成凝膠溶液。

(3)將灌膠裝置準(zhǔn)備好。

(4)待凝膠溶液平衡至室溫(23~25℃)后，真空脫氣15min。2023/2/6421）.安裝膜具①將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,將凡士林均勻的涂在兩側(cè)的封條上，用封條將玻璃板封好。

②稱取2g瓊脂糖加100ml蒸餾水，慢慢的煮開（煮的過程中要不斷攪拌），將煮好的(無氣泡)瓊脂糖倒入支膠架三分之二高度，快速將兩側(cè)封好的玻璃板插入瓊脂糖中，注意凹槽朝外，用夾子固定好，待凝固后灌膠。2023/2/6432）制備SDS聚丙烯酰胺凝膠

①制備分離膠30%丙烯酰胺5ml+分離膠緩沖液5ml+10%SDS0.2ml+10%過硫酸銨0.2ml+蒸餾水9.6ml；混勻后加入8ulTEMED,立即混勻（不能有氣泡），灌入安裝好的垂直板中，灌膠時要勻速貼壁流入，防止氣泡產(chǎn)生。灌至離槽沿3cm處，立即在膠面上用移液管加入1-2cm的蒸餾水，靜置，待凝膠聚合后（約30min），去除水相，然后用吸水紙吸干殘余的水。2023/2/644②制備濃縮膠30%丙烯酰胺1.32ml+濃縮膠緩沖液1ml+10%SDS0.08ml+10%AP0.08ml+蒸餾水5.6ml；混勻后加入8ulTEMED,立即混勻（不能有氣泡），灌入垂直板至離槽沿0.5cm處，插入梳子（不能混入氣泡），靜置，待凝膠聚合后，加入電泳緩沖液，拔去梳子。2023/2/645③先用刀片將瓊脂糖剝離開，再將玻璃板從架子上取出，再用夾子固定在電泳槽內(nèi)（注意凹槽朝內(nèi)），將電泳緩沖液倒入電泳槽內(nèi)。

3).樣品預(yù)處理

取0.5ml樣品加入0.5ml上樣緩沖液，置沸水中煮5分鐘。

4).上樣

①第一個孔內(nèi)加20ul標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

②其他每孔加入20ul樣品。上樣時要將移液槍頭垂直插入孔內(nèi)且要緩慢勻速推入樣品。2023/2/646

垂直板電泳裝置加樣樣品遷移方向2023/2/6475).電泳

接通電源，將電壓調(diào)至80V、50mA。當(dāng)溴酚蘭進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到150V、80mA，電泳至溴酚蘭距離膠底部1-2cm處，停止電泳。

6).固定

取下凝膠，置于培養(yǎng)皿中的固定液中，輕輕振搖10分鐘，倒去固定液。

7).染色脫色

培養(yǎng)皿中倒入50-60度預(yù)熱的染色液浸沒凝膠，約40分鐘后回收染色液，用清水沖洗掉膠上多余的染色液。倒入脫色液，脫色2小時，期間換脫色液2-3次。2023/2/648電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠穾Э啄z

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子2023/2/649夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源2023/2/650標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。

相對遷移率７.結(jié)果處理

2023/2/651實驗注意事項

1.形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。2.

注意不能隨便傾倒單體溶液，應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。2023/2/6523.

TEMED中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。2023/2/6534.

過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時過硫酸銨不易過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠)。2023/2/6545.

激活劑的用量:

激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時，聚合鏈長度過短，將不會形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。2023/2/655

6.溫度的影響聚膠的最佳溫度為23~25℃，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4℃冰箱)及玻璃板或管(有時從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時快。2023/2/656

7.氧氣的影響氧氣會與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度脫氣至少15min。

2023/2/657

8.凝膠添加劑：凝膠中常常加入SDS、尿素、TritonX-100等添加劑。SDS加入后不會對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。2023/2/658

9.

聚膠時間：雖然應(yīng)用過硫酸銨／TEMED催化后灌膠15~20min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90min才能保證95％以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時聚膠時間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對孔徑大小要求不高，因此不必等很長時間(完全聚合需8h)。2023/2/659

10.單體的濃度：是指單體總重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(w／v)，可選擇的范圍為3％~30％，單體濃度增加后聚合速度將加快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。

11.

SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。

2023/2/66012.

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且SDS測定分子量有10％誤差，不可完全信任。13.

有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。

2023/2/66114.

有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。

15.

如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。2023/2/662常見問題及處理辦法１、紋理和拖尾現(xiàn)象

由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。２、蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。３．電泳時間比正常要長

可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯誤。４．指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。

2023/2/663５.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形）。

由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全．６.凝膠時間不對。

通常膠在30min內(nèi)凝聚．如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS劑不夠或者失效。7.出現(xiàn)“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。2023/2/6648.出現(xiàn)“鬼帶”如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，