細菌藥敏試驗20543

第四章

抗菌藥物敏感試驗

黃露萍抗菌藥物敏感試驗測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感性試驗（AntimicrobialSusceptibilityTest），簡稱藥敏試驗（AST）。藥敏試驗的意義預測抗菌治療的效果；指導抗菌藥物的臨床應用；發(fā)現(xiàn)或提示細菌耐藥機制的存在，能幫助臨床醫(yī)生選擇合適的藥物，避免產(chǎn)生或加重細菌的耐藥；監(jiān)測細菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學，以控制和預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。藥敏試驗MIC：在與微生物生長速率有關的特定時間間隔內(nèi)，通常是18～24小時，能夠抑制被測菌生長的最低藥物濃度。對倍稀釋的優(yōu)點：操作容易敏感株的MIC呈正態(tài)分布區(qū)分異常(R)與敏感(S)的菌群藥敏試驗折點的建立1.MIC的分布

2.藥代動力學和藥效學 定MIC的折點3.臨床療效和細菌清除率4.抑菌圈直徑的分布………定抑菌圈折點統(tǒng)計學的線性回歸計算錯誤率：盡可能減少極重要誤差(假敏感率)MIC的分布藥代動力學和藥效學藥代動力學：藥物吸收，分布，代謝，排泄藥效學：藥物對機體的作用時間依賴型（％T>MIC〕：β-內(nèi)酰胺類，大環(huán)內(nèi)酯類濃度依賴型（AUC/MIC比率〕：AGS,FQ這些參數(shù)可用于計算具有最佳藥效的給藥方案MIC與抑菌圈直徑的線性關系耐藥中介敏感RISLog2.MICD1d2抑菌圈直徑（mm)v抑菌圈直徑與MIC的關系不同國家的判定折點

－可能不同原因：用藥劑量不同，服藥的間隔不同評價敏感時較保守更強調(diào)檢測出耐藥株（即特定的耐藥群）技術因素：接種、培養(yǎng)基在我國主要遵循臨床實驗室標準化委員會（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則。

CLSI的簡單介紹NCCLS（TheNationalCommitteeforclinicallaboratoryStandards）美國臨床實驗室標準委員會已經(jīng)被我國衛(wèi)生部指定為部頒標準每年有新版CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）美國臨床實驗室標準化研究所

2012年CLSI臨床微生物檢驗標準及操作規(guī)范M100-S20Tables：抗菌藥物敏感性試驗的實施標準M2-A10：紙片擴散法敏感性試驗的實施標準M07-A8：需氧菌稀釋法敏感性試驗方法M11-A7:

厭氧菌敏感性試驗方法M47-A8:

血培養(yǎng)的原則和步驟M35-A2:

細菌及酵母樣真菌的鑒定方法簡本*M100每年更新一次**M2,M7每三年更新一次3判斷折點特殊的耐藥監(jiān)測

標準菌株質(zhì)控范圍藥物分組敏感性分類(CLSI的定義)敏感（Susceptible）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時達到的平均血藥濃度超過細菌的MIC5倍以上。耐藥（Resistance）用常規(guī)用量治療不能抑制細菌的生長MIC高于藥物在血、體液中可能達到的濃度敏感性分類（2）中介(Intermediate)MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應率低于敏感株藥物生理濃集部位有效(尿-FQ)加大用藥劑量可能有效緩沖區(qū)：防止操作的系統(tǒng)誤差造成重大結果的判定錯誤藥敏試驗的方法學半定量…紙片擴散法(抑菌圈直徑)MIC法：稀釋法(肉湯、瓊脂)自動化儀法抗生素連續(xù)梯度法(Etest)流式細胞儀

將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關關系。紙片擴散法（Kirby-Bauer法）操作方法：1.將在約56℃恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度4mm。2.無菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個菌落。3.置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarlandNo0.5管。4.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。5.平板置室溫干燥3~5分鐘，用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中距離應大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應大于15mm。6.蓋上平板的蓋子，置35℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育16~18小時后閱讀結果，對苯唑西林和萬古霉素敏感等應孵育24小時。7.用游標卡尺或直尺量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標準，報告細菌對該抗生素敏感(susceptible,S)、耐藥(resistant,R)、中介(intermediate,I)。2023/2/625紙片擴散法－影響因素MIC接種菌量細菌生長率抗生素含量、擴散性平皿厚度溫度，預孵育時間2023/2/626紙片擴散法－標準化CLSI：美國實驗室標準化委員會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)每年修訂更改包括質(zhì)控新藥的判定標準特殊耐藥性的檢測2023/2/627CLSI的法規(guī)規(guī)定紙片含量、接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、判定標準、質(zhì)控；規(guī)定常規(guī)測試報告的抗生素；不同的藥判定標準不同；不同的菌判定標準也不同。2023/2/628常規(guī)測試并報告的藥物分組(1)

腸桿菌科

綠膿和非腸桿菌科一級氨芐西林頭孢他啶，慶大霉素頭孢唑林，慶大霉素 替卡西林，哌拉西林二級阿米卡星 阿米卡星氨芐西林/舒巴坦頭孢吡肟，頭孢哌酮

阿莫西林/克拉維酸 氨曲南頭孢呋肟，頭霉素 環(huán)丙沙星，亞胺培南頭孢噻肟，頭孢曲松替卡西林/克拉維酸

環(huán)丙沙星，亞胺培南妥布霉素，復方磺胺

替卡西林，哌拉西林 三級氨曲南，頭孢他啶 頭孢曲松卡那霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星妥布霉素 四環(huán)素，氯霉素

2023/2/629常規(guī)測試并報告的藥物分組(2)

葡萄球菌

腸球菌一級苯唑西林，青霉素青霉素，氨芐西林二級紅霉素類 萬古霉素克林霉素，萬古霉素三級氯霉素 慶大霉素2023/2/630常規(guī)測試并報告的藥物分組(3)

流感嗜血桿菌

肺炎鏈球菌一級氨芐西林，青霉素 青霉素，紅霉素復方磺胺

復方磺胺二級頭孢呋肟，頭孢噻肟 氧氟沙星，四環(huán)素頭孢他啶，氯霉素萬古霉素三級阿奇霉素，頭孢克羅 氯霉素，利福平環(huán)丙沙星，亞胺培南 利福平，四環(huán)素2023/2/631預報用藥(一)

測試藥 菌名 推測其他藥物的敏感性苯唑西林 葡萄球菌 所有β-內(nèi)酰胺類四環(huán)素 所有（除葡 多西環(huán)素，米諾環(huán)素

萄球菌和不 動桿菌〕紅霉素 G＋球菌 羅紅霉素，克拉霉素，

阿奇霉素克林霉素 所有 林可霉素2023/2/632預報用藥(二)測試藥 菌名 推測其他藥物的敏感性氨芐西林 腸球菌 青霉素青霉素G 葡萄球菌 氨芐西林，美洛西林

替卡西林頭孢噻吩 腸桿菌科 頭孢拉定，頭孢氨芐

頭孢克羅奈啶酸

腸桿菌科 所有氟喹諾酮類萬古霉素

所有 替考拉寧以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），經(jīng)培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。稀釋法中用瓊脂培養(yǎng)基者為瓊脂稀釋法，用肉湯培養(yǎng)基者為肉湯稀釋法。藥敏試驗-稀釋法常用抗菌藥物容積稀釋法步驟濃度（mg/mL）來源體積(mL)CAMHB(mL)最終濃度（mg/mL）15120儲存液195122512步驟1112563512步驟1131284512步驟11764564步驟41132664步驟41316764步驟417888步驟711498步驟7132108步驟7171111步驟10110.5121步驟10130.25131步驟10170.125原理：聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實驗時加入100μl濃度為105CFU/ml的菌液，蓋上蓋板，35℃16～20h觀察結果。孔底部清晰不出現(xiàn)細菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對細菌的最小抑菌濃度，通過CLSI標準判斷其敏感和耐藥。再取0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀察無菌生長的液體接種于血瓊脂平板作次代培養(yǎng)，經(jīng)35℃過夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死99.9％原始種入的細菌即為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。微量液體稀釋法(microdilutiontest)

操作方法：1.抗菌藥物的稀釋和融解2.在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素

100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。3.挑選18~24小時的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時。4.制備0.5麥氏比濁管，然后1:200稀釋，使之最終濃度105CFU/ml。5.用微量加樣器接種100μl

到96孔中，蓋上蓋板。同時作陽性、陰性對照。6.手工看濁度或儀器自動判讀。按照CLSI標準報告細菌對某抗菌藥物為敏感、耐藥和中介。閱讀結果的正確光源細菌反射光透射光細菌反射光透射光腸桿菌科細菌√肺炎鏈球菌√(移去蓋子)銅綠假單胞菌√β-、草綠色鏈√(移去蓋子)不動桿菌屬細菌√嗜血桿菌屬√伯克霍爾德菌√淋病奈瑟菌√(移去蓋子)葡萄球菌√VAN、OXA、LIN腦膜炎奈瑟菌√(移去蓋子)腸球菌√VAN弧菌屬√注：閱讀葡萄球菌中應注意的紙片法藥敏結果是任何有可見的菌落生長均應視作對VAN、OXA、LIN抗菌藥物耐藥2023/2/641肉湯稀釋法4 8 16 3264128256ug/ml混

混清抗生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml，孵育35℃，16～20h，判讀。2023/2/642瓊脂稀釋法

濃度16 32 64128256ug/ml制備含對倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點種菌，104/每個點，孵育，判讀結果2023/2/643肉湯稀釋法調(diào)節(jié)離子濃度的MH肉湯宏量肉湯法（2ml,13x100mm） 微量肉湯法（0.1ml,微量板）自動化儀優(yōu)點：準確，可靠，可用于研究。缺點：勞動強度大細菌生長情況不可查2023/2/644瓊脂稀釋法優(yōu)點：金標準精確可靠可同時測定多株菌（40株）細菌生長情況可查缺點：測多個藥時勞動強度大制備平皿費時費力Etest法E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度；抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍；將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度。操作方法：1~4步驟與紙片擴散法相同。5.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置6條，9mm平板只能放置1～2試條。6.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。7.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交處的刻度即為抗菌藥物對該菌的最低抑菌濃度(MIC)。2023/2/6wanghui-ART48Etest法

細菌生長區(qū)Etest塑料條橢圓形細菌生長抑制區(qū)2561288016判讀抑菌濃度（MICug/ml)2023/2/649Etest法優(yōu)點連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡單，省時缺點：昂貴用途：快生長菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌，分枝桿菌2023/2/650聯(lián)合藥物敏感試驗體外聯(lián)合藥物敏感試驗的目的：擴大抗菌譜，治療混合感染預防或推遲細菌耐藥性的發(fā)生聯(lián)合用藥可以減少劑量景避免達到毒性劑量對某些耐藥細菌引起的嚴重感染，聯(lián)合用藥比單一用藥時效果更好。聯(lián)合藥物敏感試驗抗菌藥物聯(lián)合用藥可出現(xiàn)4種結果：無關作用：兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨活性。拮抗作用：兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨抗菌活性。累加作用：兩種藥物聯(lián)合作用時的