第一講分光光度技術(shù)

高級(jí)生化與分子生物學(xué)技術(shù)食品與生物工程學(xué)院生物工程教研室主講人：李愛(ài)貞杜翠紅azli@第一講分光光度技術(shù)1概述2朗白比爾定律3顯色反應(yīng)4顯色劑5測(cè)量誤差及測(cè)量條件6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)7分光光度技術(shù)的應(yīng)用非光譜法：

如折射法，濁度法，旋光法不以光的波長(zhǎng)為特征訊號(hào)，比較有色溶液顏色深淺。光譜法：光學(xué)分析法1概述在光（或其它能量）的作用下，通過(guò)測(cè)量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度來(lái)來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的技術(shù)。分為：吸光光度法，發(fā)射光譜法真空紫外光度法：10～200nm（遠(yuǎn)紫外光）紫外吸光光度法：200400nm（近紫外區(qū)）

可見(jiàn)吸光光度法：400750nm

紅外光度法：2.51000m4電磁波譜波譜區(qū)名稱波長(zhǎng)范圍頻率范圍(MHZ)躍進(jìn)能級(jí)類型射線0.005～0.14nm6×1014～2×1012核能級(jí)X射線0.0001～10nm3×1014～3×1010

內(nèi)層電子能級(jí)遠(yuǎn)紫外光10～200nm3×1010～1.5×109內(nèi)層電子能級(jí)近紫外光200～400nm1.5×109～7.5×108原子及分子的階電子或成鍵電子能級(jí)可見(jiàn)光400～750nm7.5×108～4.0×108原子及分子的階電子或成鍵電子能級(jí)近紅外光0.75～2.5m4.0×108～1.2×108分子振動(dòng)能級(jí)中紅外光2.5～50m1.2×108～6.0×106分子振動(dòng)能級(jí)遠(yuǎn)紅外光50～1000m6.0×106～3×105分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)微波0.1～100cm3×105～3×102分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)射頻1～1000m3×102～0.3電子自旋/核自旋當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透過(guò)光的強(qiáng)度會(huì)減弱。因?yàn)樗殖闪巳糠郑涸谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?；溶液中物質(zhì)所吸收；透過(guò)溶液。入射光=反射光+分散光+吸收光+透過(guò)光“空白”校正：在檢測(cè)過(guò)程中，若用蒸餾水或待測(cè)溶液的溶劑作為“空白”校正反射、分散等因素所造成的入射光的損失，則：入射光(I。)=吸收光+透過(guò)光(I)光譜分析技術(shù)的分類

分子吸收法:可見(jiàn)與紫外分光光度法、紅外光譜法分子光譜

分子發(fā)射法:分子熒光光度法光譜技術(shù)原子吸收法：原子吸收法原子光譜原子發(fā)射法：發(fā)射光譜分析法、原子熒光法等

透過(guò)光強(qiáng)度與有色溶液中吸收物質(zhì)的分子數(shù)量c以及透過(guò)溶液的厚度L有關(guān)。是紫外－可見(jiàn)吸收法定量分析的基礎(chǔ)。

I0：入射光強(qiáng)度C:溶液濃度

b:液層厚度I:透射光強(qiáng)度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系數(shù)bI0I2朗伯-比爾定律

1.入射光為單色光。波長(zhǎng)范圍越大，單色光純度越低，偏離越大；

2.溶液中鄰近分子的存在并不改變每一給定分子的特性，即分子間互不干擾。

3.適用于分子吸收和原子吸收。朗伯-比爾定律的適用條件9吸光度可加性原理員工隊(duì)伍規(guī)劃現(xiàn)有員工隊(duì)的描述未來(lái)的員工隊(duì)伍預(yù)測(cè)差距分析

某一波長(zhǎng)的入射光通過(guò)幾個(gè)相同厚度的不同溶液，其總的吸光度為各溶液吸光度之和。同樣如果溶液中含有不同的吸光物質(zhì)，只要各組分間沒(méi)有相互作用，溶液的總吸光度為各組分吸光度之和。吸光度可加性原理是十分有用的，例如進(jìn)行光度分析時(shí)，試劑或溶劑有吸收，則可從所測(cè)總吸光度中直接進(jìn)行扣除，這就是以試劑或溶劑做空白的依據(jù)。10

3顯色反應(yīng)及其影響因素分光光度法對(duì)顯色反應(yīng)的要求選擇性好、干擾少或干擾容易消除。靈敏度高。一般選擇生成有色化合物的摩爾吸光系數(shù)高的顯色反應(yīng)。有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。有色化合物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)足夠穩(wěn)定，至少保證在測(cè)量過(guò)程中溶液的吸光度變化很小。有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大。11?

顯色劑的用量?溶液的酸度?

顯色溫度?顯色時(shí)間?溶劑?溶液中共存離子的影響影響顯色反應(yīng)的因素

4顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑因生成的絡(luò)合物不夠穩(wěn)定，靈敏度和選擇性不高，目前應(yīng)用較少。常用的有硫氰酸鹽、鉬酸銨和過(guò)氧化氫等。有機(jī)顯色劑該類顯色劑大都屬于含有生色團(tuán)和助色團(tuán)的化合物。在有機(jī)化合物分子中，一些含有不飽和鍵的基團(tuán)，它們能吸收大于200nm波長(zhǎng)的光，這種基團(tuán)稱為廣義的生色團(tuán)。大多數(shù)有機(jī)顯色劑與金屬離子生成極穩(wěn)定的鰲合物，且具有特征的顏色，故選擇性和靈敏度都較高。不少鰲合物宜溶于有機(jī)溶劑，可以進(jìn)行萃取比色，這對(duì)進(jìn)一步提高靈敏度和選擇性很有利。

5測(cè)量誤差和測(cè)量條件的選擇測(cè)量誤差

化學(xué)誤差（經(jīng)化學(xué)反應(yīng)將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)榘ㄓ猩衔锛案鞣N絡(luò)合物的過(guò)程）、儀器的誤差、人為的誤差。測(cè)量條件的選擇

pH、溶劑、溫度、測(cè)定時(shí)間（時(shí)間曲線）、入射光波長(zhǎng)（最大吸收峰波長(zhǎng)、次吸收峰波長(zhǎng)）、參比溶液。14?測(cè)量相對(duì)誤差與吸光度的關(guān)系分光光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差，實(shí)踐證明，吸光度在0.20～0.80內(nèi)測(cè)量的相對(duì)誤差較小。相對(duì)誤差的最小的部分在透光度為36.8％處(或吸光度為O.4343處)。解決辦法：控制被測(cè)溶液的濃度選擇不同的比色皿（比色皿的光程長(zhǎng)度為10、30、50、100mm，吸光度小的要用長(zhǎng)的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。）15

參比溶液的選擇?被測(cè)液中僅顯色劑與待測(cè)組分生成有色化合物，而顯色劑與其他試劑無(wú)色，溶液中亦無(wú)其他有色離子時(shí)，可用蒸餾水或去離子水作為參比溶液。?除顯色劑與待測(cè)組分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色離子，而且顯色劑無(wú)色，此時(shí)可用不加顯色劑的被測(cè)液作為參比溶液。?當(dāng)顯色劑本身具有顏色時(shí)，則用顯色劑溶液作為參比溶液。如果顯色劑和被測(cè)溶液都有色時(shí)，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，把被測(cè)組分掩蔽起來(lái)，使之不再與顯色劑反應(yīng)，再加入與被測(cè)溶液相等的顯色劑和其他試劑，這樣的參比溶液能消除共存組分的干擾。6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分光光度計(jì):能從含有各種波長(zhǎng)的混合光中將每一單色光分離出來(lái)并測(cè)量其強(qiáng)度的儀器。分析精密度高測(cè)量范圍廣分析速度快樣品用量少射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光根據(jù)使用的波長(zhǎng)范圍不同分為紫外光區(qū)、可見(jiàn)光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬(wàn)用（全波段）分光光度計(jì)等。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：工作波段在200nm～800nm的分光光度計(jì)。200nm～400nm為紫外光區(qū)。400nm～800nm為可見(jiàn)光區(qū)。721可見(jiàn)分光光度計(jì)

722系列可見(jiàn)分光光度計(jì)

SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TENSOR系列紅外光譜儀

0.208光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示系統(tǒng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)示意圖

光源（lightsource）：提供入射光的裝置。要求:1.能在所需波長(zhǎng)范圍的光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜；

2.有足夠的輻射強(qiáng)度并能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定。常用的光源有熱輻射燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等。幾種常見(jiàn)光源比較光源波長(zhǎng)范圍(nm)

特點(diǎn)鎢燈320~2500鎢絲易蒸發(fā)，壽命短。用于可見(jiàn)光區(qū)鹵鎢燈320~2500加入鹵素使用壽命延長(zhǎng)，穩(wěn)定性好氫燈185~375用于紫外區(qū)氘燈185~375發(fā)光強(qiáng)度比氫燈高3～5倍汞燈254~734用于紫外或熒光分析儀單色器（Monochromator）：是將來(lái)自光源的復(fù)合光分解為單色光并分離出所需波段光束的裝置。入射狹縫：限制雜散光進(jìn)入；色散元件：將復(fù)合光分解為單色光，有棱鏡和光柵兩種；準(zhǔn)直鏡：將來(lái)自色散元件的平行光束聚集在出射狹縫上；出射狹縫：將固定波長(zhǎng)范圍的光射出單色器，可以限制通帶寬度。吸收池（absorptioncell）：是用來(lái)盛放被測(cè)溶液的器件。在可見(jiàn)光區(qū)常用無(wú)色光學(xué)玻璃或塑料制作；在低于350nm的紫外區(qū)需用能透紫外線的石英或熔凝石英制作。同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射應(yīng)嚴(yán)格保持一致。指紋、油污及池壁上的沉淀物都會(huì)影響吸收池的透光性能。微型吸收池（Microdrillabsorptioncell）：“光程/體積比”提高了近10倍。多光路吸收池（Multipie-pathabsorptioncell）：在吸收池壁上裝有反射鏡，使光線在溶液中經(jīng)多次反射后才離開(kāi)吸收池，大大增加了有效光程，提高了測(cè)定的靈敏度。通過(guò)改進(jìn)吸收池的幾何形狀，可提高“光程/體積比”，即盡可能延長(zhǎng)單位體積的光程。常用的有：檢測(cè)器：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置。對(duì)檢測(cè)器的要求：產(chǎn)生的電信號(hào)與照射到它上面的光強(qiáng)有恒定的函數(shù)關(guān)系；波長(zhǎng)響應(yīng)范圍大；靈敏度高；響應(yīng)速度快，一般要求小于10-8s；產(chǎn)生的電信號(hào)易于檢測(cè)、放大，噪聲低。幾種常用檢測(cè)器比較檢測(cè)器

工作原理

特點(diǎn)光電管外光電效應(yīng)簡(jiǎn)單,靈敏度低光電倍增管外光電效應(yīng)與多級(jí)二次發(fā)射體相結(jié)合靈敏度比光電管高200多倍光電二極管陣列外光電效應(yīng)，由一行光敏區(qū)和二行讀出寄存器構(gòu)成可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)波長(zhǎng)的光強(qiáng)度。壽命長(zhǎng)、光譜響應(yīng)范圍寬、可靠性高、讀出速度快光電池內(nèi)光電效應(yīng)結(jié)實(shí)、便宜、使用方便。但產(chǎn)生的電流大小不穩(wěn)定電荷耦合器件模擬集成電路芯片能同時(shí)多譜線檢測(cè)，極大地提高分析速度7分光光度技術(shù)的應(yīng)用

A測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量比色法：測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度已知的溶液)和未知液(濃度待測(cè)定的溶液)的吸光度，將兩者進(jìn)行比較。

Ax/As=KCxL/KCsL，即：Cx=Ax×Cs/As式中Cx代表未知液的濃度，Cs代表標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，Ax和As分別代表未知液和標(biāo)準(zhǔn)液所測(cè)得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式計(jì)算得之。分光度法：先測(cè)出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線。測(cè)定出未知液的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對(duì)應(yīng)的濃度。含量測(cè)定時(shí)所用波長(zhǎng)通常要選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，原因：①靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；②可以避免其他物質(zhì)的干擾。

B用紫外光譜鑒定化合物使用分光光度計(jì)可以繪制吸收光譜曲線。方法：用各種波長(zhǎng)不同的單色光分別通過(guò)某一濃度的溶液，測(cè)定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度—波長(zhǎng)曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有其特定的吸收光譜曲線通過(guò)比較未知物質(zhì)與已知物質(zhì)的吸收光譜曲線形狀（吸收高峰和低谷的波長(zhǎng)）來(lái)確定紫外光吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物能表現(xiàn)出吸收峰。紫外光吸收光譜比較簡(jiǎn)單，同一種物質(zhì)的紫外光吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨(dú)依靠紫外光吸收光譜不能決定一個(gè)未知物的結(jié)構(gòu)，必須與其他方法配合。紫外光吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度分析。使用分光光度計(jì)注意事項(xiàng)儀器須安放在穩(wěn)固的工作臺(tái)上，不能隨意搬動(dòng)。嚴(yán)防震動(dòng)，潮濕和強(qiáng)光直射。盛裝比色液時(shí)，約達(dá)比色皿2/3體積，不宜過(guò)多或過(guò)少