儀器分析熒光分析法2課件

第十二章熒光分析法fluorometry1概述某些物質(zhì)受到光照射時，除吸收某種波長的光之外還會發(fā)射出比原來所吸收的光的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，最常見的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。

2熒光的分類根據(jù)物質(zhì)是分子還是原子：分子熒光

原子熒光

根據(jù)照射光的種類：紫外熒光X射線熒光紅外熒光方法測定靈敏度10-1010-12g/ml

3S0V=0123S1*S2*VnT1*熒光與磷光產(chǎn)生示意圖52.熒光和磷光產(chǎn)生振動弛豫vibrationalrelexation內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換internalconversion熒光發(fā)射fluorometry外部能量轉(zhuǎn)換externalconversion體系間跨越intersystemcrossing磷光的產(chǎn)生6（二）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜光源單色器1單色器2檢測器excitationspectrum

橫坐標ex，縱坐標發(fā)射光強度fluorescencespectrum

橫坐標em，縱坐標發(fā)射光強度7斯托克斯位移’=-’9熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)不管分子激發(fā)到s1還是s2，熒光的發(fā)生總是從s1開始，熒光光譜的形狀是一樣的。熒光強度(nm)40030050010熒光強度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)11求熒光壽命Ft=F0e-t/flnF0Fttf=lnF0Ftt直線斜率為1f13fluorescenceefficiency

(fluorescencequantumyield)f=發(fā)射熒光的光子數(shù)吸收激發(fā)光的光子數(shù)14（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性取代基152.分子的剛性同樣具有*躍遷的長共軛分子中，剛性和共平面性越大，越大，長移。CH2f=0.2f=1.017剛性和共平面性增加電子的共軛程度增加-COO-COO-COO-O熒光素鈉酚酞18原來不發(fā)生熒光的，如：8-羥基喹啉N-OHN-OMg1/2Mg原來共平面性較好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘-7-磺酸鹽1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽

19（三）熒光試劑熒光胺Dansyl-Cl鄰苯二甲醛(OPA)測定無機離子的熒光試劑21熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺反應(yīng)COOHONROH-NH2R-NH2ex275,490nmem480nmOOOO22Dansyl-Cl與伯仲胺及酚羥基反應(yīng)NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+RNH2無水丙酮+HClex365nmem~500nm23無機離子一般本身沒有熒光，但與一些有機試劑生成配合物后，可產(chǎn)生強烈熒光N-OHN-OLi+Li+ex370nmem580nmP235表12-125有些無機陰離子可使熒光熄滅N-OHN-OAl1/3+Al+CN-使熒光熄滅或減弱F-26

熒光熄滅劑的影響熒光熄滅劑quenchingmedium發(fā)生碰撞而使之失去能量生成不發(fā)光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，實現(xiàn)體系間跨越，轉(zhuǎn)變成三線態(tài)。熒光熄滅法fluordscencequenchingmethod熒光自熄滅C>1g/l29散射光的干擾scatteringlight光子與物質(zhì)分子碰撞彈性碰撞非彈性碰撞碰撞雙方能量不變光子運動方向改變碰撞過程中發(fā)生能量傳遞，同時光子運動方向發(fā)生改變ReyleighscatteringlightRamanscatteringlight30硫酸奎寧在不同ex的熒光與散射光譜Fnm320448350448360400ex320nmReyleigh320nmRaman360nmem448nmex350nmReyleigh350nmRaman400nmem448nm對測定無影響對測定有影響31在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長32I0IF第三節(jié)定量分析方法一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系F=K’(I0-I)I=I010-ECLF=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)33e-2.3ECL=1+F=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)(-2.3ECL)11!+(-2.3ECL)22!F=K’I0[1-(1+(-2.3ECL)11!(-2.3ECL)22!++…)](-2.3ECL)33!+=K’I0[2.303ECl-(-2.3ECL)22!(-2.3ECL)33!-…]若C很小，ECl≤0.05則F=2.3K’I0ECl=KC+…34F=2.3K’I0ECl=KCECl≤0.05FCECl

>0.05F與C不成正比熒光法紫外法FA=-lgT=-lgI

/I0

熒光分析法的靈敏度高于紫外-可見分光光度法35二、定量分析方法標準曲線法比例法多組分分析C1C2C3C4C5100%2060804080%16486432用空白溶液調(diào)零用標準溶液調(diào)滿刻度36比例法（對比法）若在某濃度范圍中成線性，可用比例法測定CsCxFsFx=CxFsFx=CsCsCxFs-F0Fx-F0=CxFs-F0Fx-F0=Cs37多組分分析各組分熒光峰不重疊，可分別測定相互重疊，可利用熒光強度的加和性，如：ba12Fa

=KaCa

+KbCb1:Fa’

=Ka’

Ca

+Kb’Cb2:38第四節(jié)儀器與熒光分析新技術(shù)光源單色器樣品池檢測器單色器放大器顯示器濾光片熒光計濾光片—單色器熒光分光光度計39儀器的校正靈敏度波長激發(fā)光譜和熒光光譜40熒光分析新技術(shù)簡介1.激光熒光分析以激光作光源，譜線更純、強度更大?？商岣哽`敏度和專一性。一次測量所需樣品液<1g，可測至10-14~10-16g。新技術(shù)儀器方面更新化學方法改善412.時間分辨熒光

time-resolvedfluorometry樣品雜質(zhì)脈沖激光10-10s10-12s423.同步熒光分析

synchronousfluorometry若：=em-exF=K’（ex）（em）CFexFemF=K’（ex）（ex+）Cf=f