第十章發(fā)光免疫技術(shù)

第十章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。

第一節(jié)概述

發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。

光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長波長的可見光（熒光）。

生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來。

化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。一、化學(xué)發(fā)光

一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可簡單地描述如下：

A十BC*C*C＋h·γ其中γ為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。

若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可表示如下：

A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化學(xué)發(fā)光效率（φCL）決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率（φCE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（φEM）?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個發(fā)光反應(yīng)都具有其特征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。二、化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光免疫分析目前分類按發(fā)光劑不同分為

1.發(fā)光酶免疫測定技術(shù)（CLEIA）

2.化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA)

3.電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(ECLIA)第二節(jié)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。

一、化學(xué)發(fā)光劑能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；⑤在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。

㈠直接化學(xué)發(fā)光劑

直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。

1.

吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。

2．三聯(lián)吡啶釕

三聯(lián)吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時(shí)失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理

㈡酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。

1．魯米諾及其衍生物

2．AMPPD1．魯米諾魯米諾發(fā)光原理魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕1.碳二亞胺（EDC）縮合法

二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)C--O2.過碘酸鈉氧化法

3．重氮鹽偶聯(lián)法4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

1．發(fā)光劑的選擇

2．被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)

3．標(biāo)記方法的選擇

4．原料比

5．標(biāo)記率

6．溫度

7．純化與保存影響標(biāo)記的因素第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型

用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至?jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測定物的濃度。二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。㈠辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。

㈡堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應(yīng)物結(jié)合在磁場中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號孵育,促使信號的產(chǎn)生信號檢測電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，

ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。

三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)指在陽極表面[Ru(bpy)3]2+

和TPA同時(shí)失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)。自由基TPA+●失去一個質(zhì)子（H+），成為自由基TPA●，這是一個強(qiáng)還原劑。TPA●

將一個電子遞給Ru(bpy)33+，而TPA被氧化。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*在衰減時(shí)發(fā)射一個波長為620nm的光子。化學(xué)發(fā)光包括電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應(yīng)體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分離。電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖標(biāo)記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測流程圖二（生物素與親和素結(jié)合）ECLIA檢測流程圖三（磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測流程圖四（電極充電啟動電化學(xué)反應(yīng)）ECLIA檢測