高溫脅迫下擬南芥POD酶活性

高溫脅迫下擬南芥過(guò)氧化物酶活性分析

生科院植物生理教研室劉太波前言

過(guò)氧化物酶（POD）是存在于各種動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化酶。催化由過(guò)氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)。多數(shù)植物過(guò)氧化物酶與碳水化合物結(jié)合成為糖基化蛋白。糖蛋白有避免蛋白酶降解和穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的作用。在正常條件下，植物體的活性氧產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)積累過(guò)多活性氧。但當(dāng)植物遭受干旱、低溫、高溫、鹽漬、高光強(qiáng)、O3和SO2等逆境，以及植物衰老時(shí)（目前有人認(rèn)為衰老也是一種逆境），體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的代謝系統(tǒng)發(fā)生變化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)失調(diào)，導(dǎo)致?O-2、,H2O2、?OH-，等活性氧在體內(nèi)的過(guò)量積累，從而對(duì)植物造成傷害。逆境對(duì)植物的影響逆境對(duì)生物的影響高溫逆境對(duì)植物的影響干旱而植物為保護(hù)自身免受活性氧的傷害，形成了內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)，包括抗氧化酶類和非酶抗氧化劑?？寡趸钢饕浅跷锲缁福⊿OD）,過(guò)氧化氫酶（CAT）,過(guò)氧化物酶（POD）,谷胱甘肽還原酶（GR）等，抗氧化劑則包括還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA），類胡蘿卜素、2—生育酚和類黃酮等。測(cè)定抗氧化酶活性、抗氧化劑含量在逆境條件下的變化情況，對(duì)于研究植物的逆境傷害和植物抗逆機(jī)制，具有重要意義。植物對(duì)逆境的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理

過(guò)氧化物酶（POD）催化過(guò)氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實(shí)驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過(guò)氧化物酶的底物，在此酶存在下，過(guò)氧化氫可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰氧基苯酚。紅棕色的物質(zhì)可用分光光度計(jì)在470nm處測(cè)定其吸光度，即可求出該酶的活性。實(shí)驗(yàn)材料10-d-oldArabidopsis(擬南芥)儀器設(shè)備臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1.5mL離心管、移液器（100和1000μL）、研缽、培養(yǎng)皿、1/2MS培養(yǎng)基、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、電子天平實(shí)驗(yàn)步驟配置1/2MS培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min；取野生型（WT）擬南芥種子，在超凈工作臺(tái)中播種到1/2MS培養(yǎng)基上，播種8皿，確保能收集到6g以上擬南芥。4℃春花處理2天，之后放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（22℃，14h光照，10h黑暗的光周期下培養(yǎng)10d）以上1，2步由教師在實(shí)驗(yàn)課兩周前準(zhǔn)備材料。實(shí)驗(yàn)步驟3.取四皿擬南芥，置于37℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)4h，對(duì)照組的四皿仍然在22℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。4.肉眼觀察傷害癥狀，并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。5.粗酶的提?。悍謩e稱取0.05g材料（全苗），加入500

μLpH=7.0PBS(磷酸鹽緩沖液),冰浴研磨，轉(zhuǎn)移1.5mL離心管中，置于10000rpm4℃離心10min,上清液即為粗酶液。實(shí)驗(yàn)步驟POD酶活性的測(cè)定：取酶液50μL于比色杯中，加入2.95mL反應(yīng)液(0.3%H2O21mL；0.2%愈創(chuàng)木酚0.95mL；pH=7.0PBS1mL)，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定λ470nm處OD值的上升速度。

以每分鐘OD值上升0.01定義為1個(gè)酶活力單位。測(cè)定兩分鐘內(nèi)OD470值的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目對(duì)照處理傷害癥