第22章免疫學檢測技術的基本原理

第22章免疫學檢測原理免疫學檢測是指借助免疫學、細胞生物學、分子生物學等理論或方法，對抗原、抗體、免疫細胞及細胞因子等進行定性、定量檢測。臨床醫(yī)學中，免疫學檢測可用于免疫相關疾病的診斷、病情檢測和療效評價等。第一節(jié)基于抗原-抗體反應的檢測方法第二節(jié)免疫細胞檢測第三節(jié)分子生物學技術在免疫學上的應用本章內容第一節(jié)基于抗原-抗體反應的檢測方法一、抗原抗體反應概念抗原與相應抗體在體內、外發(fā)生的高度特異性結合反應。在合適條件下所進行的體外反應中，抗原與相應抗體特異性結合可呈現(xiàn)某種反應現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實驗所用抗體存在于血清中，故又稱血清學反應。二、抗原抗體反應的特點高度特異性可精確區(qū)分物質間極微細的差異。表示為親和力：一個抗原表位與相應抗體單一抗原結合位點間的結合能力。親合力：指一個抗體分子與整個抗原大分子間的結合強度，與抗原表位數(shù)目有關。2.抗原抗體結合的帶現(xiàn)象與可見性抗原抗體結合存在帶現(xiàn)象（前帶、等帶、后帶），適宜的抗原抗體濃度和比例（等帶）決定抗原抗體結合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應；3.表面化學基團之間的可逆結合抗原抗體結合除了空間結構互補外，主要以氫鍵、范德華力和疏水鍵等非共價結合。易受溫度、酸堿度和離子強度的影響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性，可借助親和層析法純化抗原或抗體?？乖贵w反應的2個階段第1階段是抗原抗體特異性結合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內完成；第2階段是小的抗原抗體復合物靠正負電荷吸引形成較大復合物，所需時間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。三、抗原抗體反應的影響因素電解質抗原抗體等電點分別為pH3-5和pH5-6，在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負電荷，適當濃度的電解質會使它們失去一部分負電荷而相互結合；溫度通常為37℃，適當提高反應溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機會，但56℃以上可使抗原或抗體變性失活；酸堿度抗原抗體反應的最適pH值在6-8之間，pH值過高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質。當pH值接近等電點時，抗原抗體多帶正負電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，導致非特異性反應。四、抗原抗體反應檢測技術的應用抗原與相應抗體在體內、外發(fā)生的高度特異性結合反應。在合適條件下所進行的體外反應中，抗原與相應抗體特異性結合可呈現(xiàn)某種反應現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實驗所用抗體存在于血清中，故又稱血清學反應。五、抗原-抗體反應的基本檢測方法AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應的原理Ab過剩Ag過剩比例適當，交聯(lián)成網(wǎng)絡Ag-Ab反應的可見性1.凝集反應直接凝集反應1:2稀釋待測血清1:41:81:16細菌、細胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質與相應Ab在電解質存在的情況下直接反應，二者比例合適時，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定選擇最佳稀釋濃度，常用于檢測抗體的滴度或效價，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達氏反應和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗。間接凝集反應將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應Ab/Ag進行反應產生凝集，叫間接凝集反應。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風濕因子檢測。凝集反應常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內anti-Rh由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細胞間的結合力不能克服細胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫姆試驗正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫姆試驗2.沉淀反應AgAgAgAgAbingel單向免疫擴散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應抗體反應后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應。沉淀反應可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度沉淀反應—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質。3.免疫標記技術免疫酶測定法免疫熒光技術放射免疫測定法免疫膠體金技術①免疫酶測定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。a）b）免疫組化技術定位、定性、定量檢測②免疫熒光技術③放射免疫測定用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結合的特異性結合起來，具有重復性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應用于激素、藥物等微量物質的檢測。常用的有131I、125I。④化學發(fā)光免疫技術將化學發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立的一種新的免疫分析技術。最常用的發(fā)光物質是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。⑤免疫膠體金技術用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術可應用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。⑥免疫印跡法-Westernblotting4.蛋白質芯片技術又稱為蛋白質微列陣，指固定于支持介質上的大量蛋白質構成的微列陣。根據(jù)蛋白質分子間特異性結合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。第二節(jié)免疫細胞檢測淋巴細胞及其亞群的分離免疫細胞功能測定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術肽—MHC四聚體技術T細胞功能測定B細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法一、免疫細胞及其亞類計數(shù)稀釋血液淋巴細胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個核細胞(PBMC，包括淋巴細胞、DC和NK)紅細胞和粒細胞血漿外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞的分離稀釋血液淋巴細胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個核細胞(PBMC，包括淋巴細胞、DC和NK)紅細胞和粒細胞血漿磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術肽—MHC四聚體技術淋巴細胞及其亞群的分離免疫吸附分離法加入淋巴細胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清磁珠分離法流式細胞術熒光抗體標記混合細胞噴嘴單細胞懸液5000-10000個/秒細胞分選器熒光檢測器抗原肽-MHC四聚體分離技術親和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素二、免疫細胞功能的測定T細胞功能測定B細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法T細胞功能測定T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應的檢測T細胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測：形態(tài)計數(shù)法：活化細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質增多、細胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機體產生免疫應答后，再用相同的抗原作皮試，可導致遲發(fā)型超敏反應，T細胞活化并釋放多種細胞因子，產生以單個核細胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達高峰。陽性反應表現(xiàn)為局部紅腫和硬結，反應強烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應，細胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應。常用于檢測某些微生物感染。B細胞功能測定抗體含量測定溶血空斑試驗可通過單項瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等測定標本中各類Ig的含量。綿羊紅細胞(SRBC)免疫動物4天后取出動物脾臟，在脾細胞懸液中含有抗SRBC的漿細胞脾細胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶血空斑。1個空斑區(qū)代表1個漿細胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細胞的數(shù)目加入新鮮補體，倒入平皿中培養(yǎng)細胞毒試驗51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法靶細胞被殺傷后，向體系中加入臺盼蘭，可進入膜破損的細胞內，將細胞染成藍色?；罴毎苋径恢?。凋亡細胞檢測法瓊脂糖電泳法正常細胞基因組DNA凋亡細胞TUNEL法在細胞中加入末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和生物素標記的核苷酸TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標記的核苷酸加入親和素-酶復合物，在DNA斷裂處顯色流式細胞術AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期壞死期巨噬細胞吞噬試驗吞噬功能測定硝基藍四氮唑(NBT)試驗NBT在殺菌過程中產生反應性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進細胞內的NBT還原成不溶性藍黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞可反映PMN的殺傷功能。將待測mf與雞紅細胞混合溫育后，雞紅細胞被mf吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細胞的mf/mf總數(shù)細胞因子檢測生物活性檢測法免疫學檢測法夾心ELISA或ELISPOT熒光素標記抗體染胞內細胞因子，F(xiàn)ACS分析細胞增殖或增殖抑制法，如細胞因子依賴性或抑制性細胞株細胞病變抑制法，如感干擾素抑制病毒感染性細胞損傷檢測B細胞產生的抗體檢測T細胞產生的CK酶聯(lián)免疫斑點試驗-ELISpot

對血細胞惡性變如白血病、淋巴瘤等的診斷，長期以來多應用細胞形態(tài)學檢查和免疫細胞表型分析。由于這些方法在特異性和敏感性上的限制，對于丟失了細胞表面標志，或分化較好難以和正常細胞區(qū)別。也可能由于惡性細胞數(shù)量少，混在大量正常細胞中難以查出。第三節(jié)分子生物學技術在免疫學上的應用一、BCR和TCR基因重排檢測

利用分子生物學，獲得Ig片段的特異基因克隆及TCR各鏈的基因克隆，分別應用Ig基因和TCR基因重排作為B細胞和T細胞的特異標記，分別診斷B細胞來源和T細胞惡性病變引起的白血病。具體操作：從待檢的細胞中分離出總DNA。非T、非B細胞的Ig和TCR基因不發(fā)生重排，稱為胚基因。而T和B細胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，轉移至硝酸纖維膜或尼龍膜上，然后用同位素或酶標記的Ig血病細胞進行分類鑒定。若有Ig基因重排說明惡性細胞來源于B細胞，若有TCR基因發(fā)生重排，則為T細胞來源的。如果既無Ig基因重排，又無TCR基因重排的淋巴細胞則屬非T、非B細胞來源的瘤細胞。總DNA胚基因TCR和Ig基因硝酸纖維膜同位素鑒定Ig基因重排TCR基因重排無重排B細胞來源T細胞來源其他細胞來源二、限制酶切片段長度多態(tài)性