微生物實驗課件實驗八質(zhì)粒提取

微生物實驗課件實驗八質(zhì)粒提取第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

質(zhì)粒(plasmid)是獨立于細菌染色體以外的能自我復(fù)制的環(huán)狀閉合的雙股DNA，質(zhì)粒DNA一般為細菌染色體的3%左右,作為基因克隆質(zhì)粒載體的所有質(zhì)粒DNA分子都必定包括如下三個共同的組成部分:復(fù)制基因、選擇標(biāo)志基因和克隆位點。

質(zhì)粒廣泛存在于細菌細胞中,此外在霉菌、藍藻、酵母和某些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在。

第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日大腸桿菌乳糖操縱子簡介：

I:調(diào)節(jié)基因P:啟動子O:操縱基因

Z、Y、A:結(jié)構(gòu)基因,其中Z編碼β-半乳糖甘酶(β-galactosidase),Y編碼透性酶(permease),A編碼乙?；D(zhuǎn)移酶(acetylase).IPOZYAOri:復(fù)制子．ＭＣＳ：multiplecloningsites,多克隆位點．第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日二、堿裂解法制備質(zhì)粒DNA

注意點：使用酚－氯仿時注意安全三、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（Agarosegelelectroghoresis）

注意點：制、看膠時，戴一次性手套，注意ＥＢ（溴化乙錠）第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日堿裂解法制備質(zhì)粒DNA（書上的原理不完全正確）

染色體DNA分子大，易斷裂乘線型DNA分子質(zhì)粒DNA共價閉合環(huán)型在堿性環(huán)境中線型的染色體DNA和環(huán)型的質(zhì)粒DNA氫鍵發(fā)生斷裂，雙鏈解開而變性，但質(zhì)粒DNA只部分發(fā)生斷裂，兩條互補鏈不會完全分離。當(dāng)pH調(diào)至中性并在高鹽濃度存在的條件下，已分開的染色體DNA互補鏈不能復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，大部分染色體DNA、不穩(wěn)定的大分子RNA和蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來。部分變性的質(zhì)粒DNA在中性環(huán)境中很快復(fù)性，呈可溶狀態(tài)保存在溶液中，離心后，存在上清中。再通過酚、氯仿、乙醇沉淀，獲得純的DNA第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日

溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III，3M醋酸鉀/2M醋酸；溶液Ⅵ：酚：氯仿：異丙醇＝25：24：1所用溶液第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的提取p143（1）新鮮培養(yǎng)含有質(zhì)粒的細菌（2）取1ml培養(yǎng)物加入1.5ml離心管中，10000rpm離心2min。（3）倒掉上清，盡可能倒干凈。（4）細菌沉淀重懸于100ul的溶液Ｉ中，用移液槍吹打至均勻。須確使細菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散(三種成分各發(fā)揮什么作用？）。第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日操作程序（5）加200μl新配制的溶液Ⅱ（問什么現(xiàn)配現(xiàn)用？怎樣發(fā)揮作用的？嚴(yán)格控制時間，為什么？）蓋緊管口，顛倒離心管幾次（不要振蕩），以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。于室溫放置２-3分鐘至液體清亮。（6）加150μl的溶液Ⅲ

(2種成分發(fā)揮怎樣的作用？仔細觀察，發(fā)生了什么現(xiàn)象？）蓋緊管口，顛倒離心管幾次（不要振蕩），以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液Ⅲ接觸。（7）4℃10000rpm離心10分種，立即將上清（400-450μl）轉(zhuǎn)移到另一離心管中。不要帶入沉淀，如有則用槍頭挑出。第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日操作程序（8）加等體積的溶液Ⅵ，振蕩、顛倒離心管幾次以沉淀DNA，于室溫放置２分鐘，小心吸取上層水相至另一潔凈的離心管中（為什么要用這3種試劑？）。（9）加入2倍體積的冷的無水乙醇，室溫放置２分鐘，10000rpm5min，在管底可見微量的DNA沉淀，小心吸棄上清液。（（10）加入1ml70%乙醇，將DNA沉淀懸浮起來后，4℃10000rpm離心５分鐘。（（11）小心吸棄上清液，將離心管倒置于一張紙巾上以吸盡液體。在室溫干燥10分鐘。（（12）取30μl滅菌水，用槍頭吹達沉淀，使其徹底溶解，取9μl的DNA樣品進行瓊脂糖電泳，其余-20℃保存?zhèn)溆谩５谑豁?，共二十七頁?022年，8月28日電泳準(zhǔn)備用透明膠封固玻璃板兩頭，在板一端放置電泳梳子。用1×TAE–buffer配制瓊脂糖凝膠(0.24gAgaros/32ml1×TAE–buffer)，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。待溶液冷卻至60℃，加入適量溴化乙錠至微紅，混勻。將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠模中，凝膠厚度在5-7mm之間。在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心地將玻璃板移至裝有1×TAE–buffer的電泳槽中，輕輕地拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面。第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日DNA電泳取9μl的DNA樣品與1μl的10*樣品緩沖液混合后，用微量取樣器慢慢將混合物加至樣品孔中。蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽極移動。當(dāng)溴酚藍在凝膠中移出適當(dāng)距離（根據(jù)DNA的大小、1kb和3kb左右的指示劑來判斷）后，切斷電源，取出玻璃板，在紫外燈下觀察，并拍照記錄結(jié)果，估測質(zhì)粒分子量的大小。第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗要求每組同學(xué)看到質(zhì)粒條帶估算出質(zhì)粒條帶的分子量大小第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗報告實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒灢襟E結(jié)果與分析思考題P145（1），（2），（3）下次實驗病毒的培養(yǎng)（雞胚接種）第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日病毒的分離與培養(yǎng)第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康睦斫獬Ｒ?guī)的病毒培養(yǎng)的基本方法掌握利用雞胚培養(yǎng)病毒的原理掌握雞胚接種的基本路徑學(xué)會雞胚的鑒別第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日病毒的種類專性活細胞寄生動物病毒雞胚接種細胞培養(yǎng)植物病毒細菌病毒第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日從病料中分離病毒一、樣本的采集與處理1、一般原則：合適的時間，合適的病變部位，合適的處理和保存方法

一般都要4℃保存第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日2、病料的種類動物樣本：（1）心、肝、肺、脾、腎臟和淋巴結(jié)等實質(zhì)性器官（2）各種液體病料（3）腸內(nèi)容物和腸壁（4）皮膚病料（5）骨（6）腦、脊髓植物樣本：發(fā)病植株的根、莖、葉、花、果等；第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日采集病料應(yīng)具有針對性：在采集病料時應(yīng)有重點地采集有關(guān)臟器、內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他材料。在無法估計病因時，可全面采集病料。進行流行病學(xué)調(diào)查、抗體檢測、群體健康評估或環(huán)境衛(wèi)生檢測時，樣品的采集數(shù)量不能太少，應(yīng)具統(tǒng)計學(xué)意義。B.無菌采樣：采集所用的器械、樣品管等均應(yīng)消毒滅菌，采集過程應(yīng)保持無菌操作，不同個體、不同組織樣品應(yīng)作好標(biāo)。C.采集新鮮病料：動物發(fā)病后應(yīng)立即采集病料，否則，尸體腐敗會影響采樣和檢測效果，特別是用于病理學(xué)檢查的病料更應(yīng)及時采集。第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日3、送檢病料樣本的標(biāo)記（1）送檢病料的物種、年齡、性別、發(fā)病日期、死亡時間等。（2）流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、病理剖檢等等初步診斷材料。（3）免疫接種和用藥治療情況。（4）病料中是否加有一些特殊的保護劑。（5）送檢的目的和要求。（6）姓名和聯(lián)系方式。第二十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日4、待檢病毒材料的處理：（1）組織材料需經(jīng)剪碎、研磨后，以漢克氏液作1：10稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各1000IU，再反復(fù)凍融3次，使病毒從細胞中釋放出來，3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液微孔濾膜過濾后作為接種物。（2）分泌物、糞便等材料則可直接以漢克氏液作1：10稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各1000IU，4℃放置過夜，3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液作為接種物。（3）接種物在接種前需做細菌培養(yǎng)試驗，只有無菌接種物才可進一步使用。（4）植物樣本經(jīng)剪碎、研磨、離心、過濾后接種植株第二十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日雞胚接種基本原理雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點：雞胚作為病毒的敏感細胞，能支持病毒完成從吸附到基因組復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，裝配，裂解的整個生命過程，從而使得病毒得以