發(fā)酵液預(yù)處理

第二章

發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離1生物技術(shù)下游加工過程的一般步驟

2預(yù)處理和固液分離內(nèi)容固液分離發(fā)酵液胞外上清液/濾液預(yù)處理提取生化物質(zhì)的第一步，分兩部分：胞內(nèi)富集細(xì)胞3發(fā)酵液成分很復(fù)雜，包含菌（細(xì)胞）體，胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物，及剩余的培養(yǎng)基殘分等。不管人們所需要的產(chǎn)物是胞內(nèi)還是胞外，都首先要進(jìn)行培養(yǎng)液的預(yù)處理和固液分離開，才能進(jìn)行后續(xù)操作：對于胞外產(chǎn)物，可先將菌體或其他懸浮雜質(zhì)去除，才能從澄清的濾液中提取代謝產(chǎn)物。對于胞外產(chǎn)物，首先富集菌體，再進(jìn)行細(xì)胞破碎和碎片分離，然后提取胞內(nèi)產(chǎn)物。42.1發(fā)酵液的預(yù)處理（Pretreatment）5為何要對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理？發(fā)酵液的基本特性發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮物顆粒小，細(xì)胞的相對密度與培養(yǎng)液相似?？蓧嚎s性液相粘度大，大多為非牛頓型流體；懸浮狀態(tài)穩(wěn)定：雙電層、水化膜、布朗運(yùn)動6為何要對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理？固液分離方法主要是過濾和離心。對于細(xì)菌及某些放線菌，菌體細(xì)小，液體粘度大，不能直接過濾，若用高速離心，能耗很大，設(shè)備昂貴。若用膜分離技術(shù)（如微濾）易產(chǎn)生膜污染，通量降低。發(fā)酵液中由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機(jī)粘性物質(zhì)的存在也會影響固液分離。因而尋找一種經(jīng)濟(jì)有效的方法來提高固液分離速度顯得十分必要。預(yù)處理是生化物質(zhì)分離純化過程中必不可少的首要步驟7預(yù)處理的目的促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離的效率：⑴改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，包括增大懸浮液中固體粒子的尺寸，降低液體黏度。⑵相對純化，去除發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)（高價無機(jī)離子、雜蛋白質(zhì)、及色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)），以利于后續(xù)各步操作。⑶盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）；

8預(yù)處理的方法凝聚和絮凝Coagulationandflocculation

加熱法Heating調(diào)節(jié)懸浮液的pH值RegulationofpH雜蛋白的去處Removalofuselessprotein高價無機(jī)離子的去處Removalofinorganicion助濾劑Filteraids和反應(yīng)劑Reactant

9一凝聚和絮凝在發(fā)酵液預(yù)處理中的應(yīng)用凝聚與絮凝處理過程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使其聚集起來,增大體積以便固液分離。凝聚和絮凝技術(shù)常用于菌體細(xì)小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。10凝聚和絮凝是兩種方法，兩個概念。凝聚：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵的鹽類）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成１mm大小塊狀凝聚體的過程。絮凝：指使用絮凝劑（天然的和合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。凝聚和絮凝11凝聚：膠體粒子在中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）

機(jī)理：

1）中和粒子表面電荷

2）消除雙電層結(jié)構(gòu)3）破壞水化膜

（一）凝聚Coagulation12發(fā)酵液中菌體表面帶有負(fù)電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。正離子同時受到使它們均勻分布的熱運(yùn)動影響，具有離開膠粒表面的趨勢。膠體雙電層結(jié)構(gòu)13兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：1）吸附層或stern層；2）擴(kuò)散層。形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。膠體雙電層結(jié)構(gòu)14吸附層：距膠核表面約一個離子半徑的Stern平面以內(nèi)，正離子被緊密結(jié)合在膠核表面，不流動。分散層：緊密層外圍反離子濃度逐漸降低直至達(dá)到主體溶液的平均濃度?；泼妫寒?dāng)膠體粒子在溶液中作相對運(yùn)動時，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大。15膠體雙電層結(jié)構(gòu)不同界面上形成不同的電位:膠核表面的電位φs是整個雙電層的電位;Stern平面上的電位為φd;滑移面上的電位為ζ,稱ζ電位（電動電位）。圖2-116ζ電位是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征，并作為研究凝聚機(jī)理的重要參數(shù)。帶電粒子間的靜電相互作用取決于ζ電位的大小。當(dāng)雙電層的ζ電位足夠大時，靜電排斥作用抵御分子間的相互吸引作用，使蛋白質(zhì)溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。17ζ電位的計算：D—水的介電常數(shù)；q—膠體的電動電荷密度，即滑移面上的電荷密度；

δ—擴(kuò)散層的有效厚度，即為吸附層和擴(kuò)散層界面處電位φd降低到其值為1/e處的距離，不能直接測定.式2-118δ—擴(kuò)散層的有效厚度式中N—阿伏伽德羅常數(shù)；T—熱力學(xué)溫度：k—波爾茲曼常數(shù)；e—電子電荷；Zi—i種反離子的化合價；Ci—i種離子的摩爾濃度。式2-219雙電層與凝聚由式（2－1）和式（2－2）可知，ζ電位與擴(kuò)散層厚度δ和電動電荷密度q成正比，而擴(kuò)散層厚度又與溶液中反離子強(qiáng)度和電荷成反比。對帶負(fù)電性菌體的發(fā)酵液，高價陽離子的存在，可壓縮擴(kuò)散層的厚度，促使ζ電位迅速降低，而且化合價越高，這種影響越顯著。20凝聚價或凝聚值在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質(zhì)，能脫除膠粒表面的水化膜，降低ζ電位，使雙電層的排斥力減少，當(dāng)不足以抗衡膠粒間的范德華引力時，由于熱運(yùn)動的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來。電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚價或凝聚值來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（毫摩爾／升），稱為凝聚價或凝聚值。21Schulze－Hardy法則：反離子的價數(shù)越高，凝聚價越小，即凝聚能力越強(qiáng)。陽離子對帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力受化合價、水化半徑、離子運(yùn)動能力的影響，次序?yàn)锳l3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+22常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO323絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過程

機(jī)理：架橋作用

采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。（二）絮凝flocculation24絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括離子基團(tuán)以及非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)結(jié)時，就形成較大絮團(tuán)，產(chǎn)生絮凝作用。

絮凝25高分子絮凝劑的吸附架橋作用26可分為四類：人工合成有機(jī)高分子聚合物、天然有機(jī)高分子聚合物、無機(jī)高分子聚合物、微生物絮凝劑1）目前常用的是人工合成有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚乙烯亞胺衍生物；聚丙烯酸類和聚苯乙烯類衍生物。工業(yè)上使用的絮凝劑27高分子聚合物絮凝劑根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：陰離子型（含有羧基)、陽離子型（含有胺基）、非離子型28聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)：存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。目前最常見：聚丙烯酰胺類絮凝劑292）天然有機(jī)高分子絮凝劑人工合成有機(jī)高分子絮凝劑雖然發(fā)展很快，但還存在著殘留單體有毒，生物降解難等問題，所以其應(yīng)用受到了限制。天然有機(jī)高分子絮凝劑具有無毒，易生物降解，原料來源廣等優(yōu)點(diǎn)。天然有機(jī)高分子改性絮凝劑根據(jù)其原料來源不同可分為淀粉類、纖維素類、植物膠類和聚多糖類。其中淀粉改性絮凝劑的研究開發(fā)最引人注目。303）無機(jī)高分子聚合物有聚合鐵系和鋁系兩大類鐵系絮凝劑具有操作簡單、費(fèi)用低，受溫度影響小，親和力強(qiáng)，能有效地去除懸浮物、表面活性劑、破壞油水乳狀液的能力很強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)腐蝕性強(qiáng)、穩(wěn)定性差。鋁系是目前應(yīng)用廣、工藝較成熟的一類無機(jī)金屬鹽絮凝劑，絮凝效果好，缺點(diǎn)具毒性等。31微生物絮凝劑微生物絮凝劑是近年來研究和開發(fā)的新型絮凝劑，一類由微生物或其分泌物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的代謝產(chǎn)物。包括直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑、利用微生物細(xì)胞壁代謝產(chǎn)物的絮凝劑和克隆技術(shù)所獲得的絮凝劑主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是安全，無毒和不污染環(huán)境。32微生物絮凝劑1、微生物絮凝劑的商業(yè)化生產(chǎn)始于20世紀(jì)90年代，如紅平紅球菌及由此制成的NOC-1是目前發(fā)現(xiàn)的最佳微生物絮凝劑

2、微生物絮凝劑或?qū)⒋蟛糠痔娲胀ㄐ跄齽?、浮游藻類、草分枝桿茵、硅酸鹽芽孢桿菌。33絮凝的影響因素發(fā)酵液的性質(zhì)（細(xì)胞濃度，表面電荷）；絮凝劑的濃度，最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋；絮凝劑的分子量；pH控制；攪拌速度。34

a.絮凝劑濃度

濃度增加有助于架橋充分，但是過多的加量會引起吸附飽和，在膠粒上形成覆蓋層而產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象。最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋；35

分子量提高、鏈增長，可使架橋效果明顯；但分子量不能超過一定的限度，因?yàn)殡S分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性降低，因此，分子量的選擇應(yīng)適當(dāng)。b.高分子絮凝劑分子量36

溶液pH的變化會影響絮凝劑功能團(tuán)的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，鏈節(jié)上相鄰離子基團(tuán)間的電排斥作用，使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，架橋能力提高。c.溶液pH37對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理，單獨(dú)使用可達(dá)到較好絮凝效果；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過濾效果。這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。（三）混凝38二預(yù)處理-加熱1）加熱降低液體粘度流體力學(xué)原理：過濾速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。液體黏度是溫度的指數(shù)函數(shù)，升溫是降低黏度的有效措施。加熱是發(fā)酵液預(yù)處理最簡單最常用的方法。加熱能改善發(fā)酵液的操作特性。麥芽汁的黏度-溫度曲線。39二預(yù)處理-加熱2）加熱使蛋白質(zhì)變性凝固變性蛋白質(zhì)的溶解度小。如檸檬酸發(fā)酵液加熱至80℃以上，可使蛋白質(zhì)變性凝固，過濾速度加快。加熱處理只適用于對熱較穩(wěn)定的液體。注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。有時加熱會增加發(fā)酵液的顏色增加后處理的難度。

40三預(yù)處理-調(diào)節(jié)pHpH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。細(xì)胞(碎片)及某些膠體物質(zhì)在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進(jìn)行。調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是除去蛋白質(zhì)的有效方法。大幅度改變pH還能使蛋白質(zhì)變性凝固。通過調(diào)整pH值改變膜過濾中易吸附分子的電荷性質(zhì)，可減少膜堵塞和污染；影響離子型絮凝劑的電離度。41

0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFigTheeffectonfiltratevolumeofpH42

案例

鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性pH3.0，加熱至70℃，維持半個小時的方法來使蛋白變性，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。43四

加入惰性助濾劑（filteraids）

助濾劑是一種顆粒均勻，質(zhì)地堅(jiān)硬，不可壓縮的粒狀惰性物質(zhì)。在發(fā)酵液中加入固體助濾劑，則菌體可吸附于助濾劑微粒上，助濾劑就作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，降低了濾餅的可壓縮性，減小了過濾阻力。目前生物工業(yè)中常用的助濾劑是硅藻土，其次是珍珠巖粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纖維素、白土等。44助濾劑的選擇(1)粒度根據(jù)懸浮液中的顆粒和濾液的澄清度確定，一般顆粒較小的濾餅應(yīng)采用細(xì)小的助濾劑。(2)助濾劑的品種應(yīng)根據(jù)過濾介質(zhì)選擇助濾劑品種。使用粗目濾網(wǎng)時易泄漏，可選擇石棉粉、纖維素；采用細(xì)目濾布時，可使用細(xì)硅藻土；(3)用量間歇操作時，過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，其厚度應(yīng)不小于2mm。連續(xù)過濾機(jī)中根據(jù)過濾速度確定。使用硅藻土?xí)r，通常細(xì)粒為500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。45五.加入反應(yīng)劑加入某些不影響目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中的一些雜質(zhì)對過濾的影響，從而提高過濾速度。

1）加入反應(yīng)劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，又能使蛋白質(zhì)凝固，過濾性能上升，沉淀本身可作為助濾劑.如在新生霉素發(fā)酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。2）發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)時，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。46發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價無機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）雜蛋白常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞，影響過濾效率。采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化，使兩相分離不清。因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。六、發(fā)酵液的相對純化

在采用離子交換提取時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。47（一）高價無機(jī)離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士蘭沉淀48（二）雜蛋白的去除方法沉淀法precipitation變性法Denaturation吸附法adsorption491.雜蛋白去除-沉淀法precipitationA等電點(diǎn)沉淀法（isoelectricprecipitation）蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大都在酸性范圍內(nèi)(p