流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期教學(xué)內(nèi)容

流式細(xì)胞術(shù)FlowCytometry（FCM）第一頁，共58頁。什么(shénme)是流式細(xì)胞儀●流式細(xì)胞儀實(shí)物(shíwù)BDFACSVantageBD-Calibur第二頁，共58頁。1.發(fā)展(fāzhǎn)歷史1934Moldavan1973Steinkamp一、

概述(ɡàishù)第三頁，共58頁。2.定義：對(duì)在高速(ɡāosù)流動(dòng)的鞘液包括下對(duì)特異熒光標(biāo)記的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù).3.特點(diǎn)測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個(gè)乃至上萬個(gè)細(xì)胞可進(jìn)行多參數(shù)測量在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來，即分選技術(shù)。第四頁，共58頁。凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置(pèizhì)的激光光源激發(fā)在生物檢測技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。4.應(yīng)用(yìngyòng)范圍第五頁，共58頁。二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本(jīběn)結(jié)構(gòu)待測細(xì)胞(xìbāo)以單個(gè)細(xì)胞(xìbāo)的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動(dòng)室。流動(dòng)室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞(xìbāo)排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞(xìbāo)液柱。液柱與激光束相交(xiāngjiāo)，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。第六頁，共58頁。第七頁，共58頁。基本(jīběn)結(jié)構(gòu)流動(dòng)室和液流系統(tǒng)(xìtǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)(xìtǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)(xìtǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)(xìtǒng)。第八頁，共58頁。三、流式細(xì)胞儀可檢測(jiǎncè)到的細(xì)胞參數(shù)

非熒光(yíngguāng)信號(hào)顆粒(kēlì)度細(xì)胞大小前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性第九頁，共58頁。血液(xuèyè)涂片第十頁，共58頁。外周全(zhōuquán)血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖第十一頁，共58頁。熒光(yíngguāng)信號(hào)熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光(jīguāng)激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光(jīguāng)光源（488nm），可測出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激光(jīguāng)光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個(gè)FL。第十二頁，共58頁。熒光信號(hào)(xìnhào)與細(xì)胞特性熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號(hào)。定量染色熒光信號(hào)大小被標(biāo)記組分(zǔfèn)含量的定量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分(zǔfèn)，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量第十三頁，共58頁。二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細(xì)胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光光信號(hào)分離，導(dǎo)向各探測(tàncè)通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。光信號(hào)(xìnhào)收集第十四頁，共58頁。三數(shù)據(jù)處理及流式報(bào)告(bàogào)FSCSSCFL1FL2FL3對(duì)數(shù)(duìshù)線性線性線性對(duì)數(shù)(duìshù)脈沖(màichōng)處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號(hào)電信號(hào)記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）第十五頁，共58頁。流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。幾個(gè)(jǐɡè)概念：%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。第十六頁，共58頁。散點(diǎn)圖密度(mìdù)圖二維等高圖直方圖圖報(bào)告(bàogào)中常見的幾種流式細(xì)胞圖第十七頁，共58頁。圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)和壞死第十八頁，共58頁。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖分析(fēnxī)第十九頁，共58頁。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析(fēnxī)第二十頁，共58頁。圖中100～101（M1）為陰性(yīnxìng)細(xì)胞，101以上的（M2）為陽性細(xì)胞第二十一頁，共58頁。五、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用(yìngyòng)

細(xì)胞結(jié)構(gòu)(jiégòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原(kàngyuán)細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位……第二十二頁，共58頁。一）細(xì)胞DNA含量(hánliàng)檢測細(xì)胞固定(gùdìng)后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，可測出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。第二十三頁，共58頁。第二十四頁，共58頁。單參數(shù)(cānshù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞(xìbāo)，4N代表G2/M期細(xì)胞(xìbāo)，兩者中間代表S期細(xì)胞(xìbāo)。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞(xìbāo)為主的流式DNA圖第二十五頁，共58頁。DNA細(xì)胞周期分析(fēnxī)細(xì)胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析(fēnxī)DNA含量(hánliàng)細(xì)胞數(shù)量2N4N

第二十六頁，共58頁。第二十七頁，共58頁。2倍體異倍體4倍體腫瘤組織(zǔzhī)中的各種DNA倍體第二十八頁，共58頁。含量與凋亡(diāowánɡ)關(guān)系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表(dàibiǎo)凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第二十九頁，共58頁。第三十頁，共58頁。第三十一頁，共58頁。二）腫瘤(zhǒngliú)診斷與抗腫瘤(zhǒngliú)藥物研究

第三十二頁，共58頁。1.腫瘤(zhǒngliú)診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷(zhěnduàn)，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷(zhěnduàn)和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷(zhěnduàn)。第三十三頁，共58頁。2倍體異倍體4倍體腫瘤(zhǒngliú)組織中的各種DNA倍體第三十四頁，共58頁。第三十五頁，共58頁。2.凋亡(diāowánɡ)研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，即凋亡(diāowánɡ)峰。檢測調(diào)亡，可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究。第三十六頁，共58頁。第三十七頁，共58頁。AnnexinVAssay

第三十八頁，共58頁。圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析(fēnxī)細(xì)胞凋亡和壞死第三十九頁，共58頁。Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試(cèshì)細(xì)胞周期分布和凋亡第四十頁，共58頁。根據(jù)(gēnjù)凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)來檢測在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月(xīnyuè)體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變小；細(xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC？SSC？細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？第四十一頁，共58頁。CD3(T細(xì)胞，CD4、CD8))、CD19（B細(xì)胞）、CD16、CD56（NK細(xì)胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤(zhǒngliú)療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。三）淋巴細(xì)胞分類(fēnlèi)第四十二頁，共58頁。第四十三頁，共58頁。第四十四頁，共58頁。流式細(xì)胞術(shù)檢測(jiǎncè)細(xì)胞表型第四十五頁，共58頁。流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的免疫表型，了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對(duì)白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理(jīlǐ)研究等有重要價(jià)值。四）白血病的免疫(miǎnyì)分型第四十六頁，共58頁。五）細(xì)胞內(nèi)蛋白(dànbái)的分析：細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光(yíngguāng)標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對(duì)含量。熒光(yíngguāng)探針多為FITC。第四十七頁，共58頁。熒光(yíngguāng)信號(hào)使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)(biǎodá)含量第四十八頁，共58頁。熒光樣本(yàngběn)制備雙色直接(zhíjiē)染色第四十九頁，共58頁。端粒（熒光(yíngguāng)蛋白）第五十頁，共58頁。

六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細(xì)胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡(pínghéng)鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)報(bào)告中給出的樣品熒光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。第五十一頁，共58頁。FCM檢測(jiǎncè)胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能第五十二頁，共58頁。M1陰性界限(jièxiàn)劃分完全是根據(jù)陰性對(duì)照！如下圖：紅色部分代表陰性對(duì)照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時(shí)等。藍(lán)色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。第五十三頁，共58頁。六.分選：用熒光(yíngguāng)探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一般分選速度為每秒鐘300個(gè)細(xì)胞，大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬個(gè)細(xì)胞第五十四頁，共58頁。488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSingle