病理學(xué)技術(shù)的應(yīng)用課件

呂自力簡(jiǎn)介女，漢族，碩士導(dǎo)師，副教授1991—19961996—19992003---20061999---QQ489506642電話：，（辦公室）病理學(xué)常用技術(shù)在科研中的應(yīng)用廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科呂自力尸體剖檢autopsy,goldstandard

活體組織檢查biopsy,frozensections.細(xì)胞學(xué)檢查cytology（一）人體病理學(xué)的診斷和研究方法:ABC（二）實(shí)驗(yàn)病理學(xué)的研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)animalexperiment組織和細(xì)胞培養(yǎng)tissue&cellculture病理學(xué)的研究方法

病理學(xué)的應(yīng)用范圍

病因?qū)W研究發(fā)病學(xué)的研究基本病理變化—揭示疾病的本質(zhì)、進(jìn)行病變?cè)\斷、分類、分期以及預(yù)后判斷藥物選擇與療效觀察新藥開發(fā)內(nèi)容免疫病理學(xué)技術(shù)常規(guī)HE染色及特殊染色分子病理學(xué)技術(shù)一、HE染色在科研中的運(yùn)用2、HE染色流程固定 取材 脫水包埋切片染色觀察

3、HE染色注意事項(xiàng)1）標(biāo)本采集組織盡可能多盡量獲取未壞死組織盡量避免擠壓組織標(biāo)記標(biāo)本的方位3、HE染色注意事項(xiàng)2）固定A.及時(shí)固定（離體30分鐘內(nèi)）B.固定液：10%的中性福爾馬林固定；C.骨髓活檢、睪丸活檢標(biāo)本也可用Bouin液固定D.電鏡標(biāo)本用2.5%戊二醛固定E.固定液與標(biāo)本體積比應(yīng)大于10：1

F.固定時(shí)間：2-4小時(shí)（?。?，12-24小時(shí)（大）特殊染色的用途2）識(shí)別組織：Masson,VG,PAS三、免疫組織化學(xué)

Immunohistochemistry,IHC原理使用范圍試劑配置操作步驟免疫組織化學(xué)的原理抗原+抗體-----顯色原位半定量蛋白試劑準(zhǔn)備切片(防脫片)多聚賴氨酸,APES一抗多抗or單抗,兔or鼠,注意種屬特異性，針對(duì)檢測(cè)組織種屬檢測(cè)試劑盒EliVisionTMplus檢測(cè)試劑盒（二步法）SP試劑盒（三步法）SABC試劑盒（三步法）顯色試劑盒DAB試劑盒其他H2O2，二甲苯，酒精，緩沖液（PBS，檸檬酸緩沖液），抗原修復(fù)液（胰酶），正常動(dòng)物非免疫血清操作步驟組織切片脫蠟，水化PBS洗3次X3分鐘抗原修復(fù)一抗（37度1h，4度過(guò)夜）封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶PBS洗3次X3分鐘二抗（37度30分鐘）PBS洗3次X3分鐘蘇木素染核自來(lái)水洗DAB顯色脫水封片PBS洗3次X3分鐘結(jié)果分析和判斷CK—胞漿陽(yáng)性細(xì)胞核陽(yáng)性---PCNA胞膜陽(yáng)性（1）判斷原則必須設(shè)立染色對(duì)照：陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照抗原表達(dá)必須在特定部位：胞膜、核、漿盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對(duì)化（2）對(duì)照設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照：已知陽(yáng)性表達(dá)的組織自身對(duì)照：同一標(biāo)本中不同組織對(duì)照陰性對(duì)照：

A、陰性組織對(duì)照：已知陰性表達(dá)的組織

B、陰性試劑對(duì)照：空白對(duì)照（4）染色失敗的原因及處理方法試驗(yàn)片：-陽(yáng)性對(duì)照片：-陰性對(duì)照片：-空白對(duì)照片：-結(jié)果：假陰性原因：操作步驟？試劑？試驗(yàn)片：+陽(yáng)性對(duì)照片：+陰性對(duì)照片：+空白對(duì)照片：+結(jié)果：假陽(yáng)性原因：切片干涸抗體濃度過(guò)高緩沖液配制不對(duì)沖洗不徹底顯色液配制不對(duì)顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)載玻片的粘合劑過(guò)厚試驗(yàn)片：+陽(yáng)性對(duì)照片：+陰性對(duì)照片：-空白對(duì)照片：+結(jié)果：假陽(yáng)性原因：非特異染色，與二抗交叉反應(yīng)。試驗(yàn)片：+陽(yáng)性對(duì)照片：+陰性對(duì)照片：+空白對(duì)照片：-結(jié)果：可疑陽(yáng)性原因：陰性對(duì)照組織選擇不準(zhǔn)確，含有靶抗原試驗(yàn)片：+陽(yáng)性對(duì)照片：+陰性對(duì)照片：-空白對(duì)照片：-結(jié)果：陽(yáng)性原因：方法可靠，實(shí)驗(yàn)片含靶抗原。陰性對(duì)照切片-，陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本和待檢測(cè)切片呈弱陽(yáng)性原因：標(biāo)本固定不當(dāng)抗體試劑問(wèn)題：濃度、效價(jià)低抗原修復(fù)不當(dāng)顯色時(shí)間短切片染色深或整張切片出現(xiàn)染色抗體濃度過(guò)高切片顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)組織沒(méi)有正確封閉沖洗不夠充分切片出現(xiàn)非特異性背景染色內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、內(nèi)源性生物素過(guò)多血清封閉時(shí)間過(guò)短抗體不純組織片內(nèi)出血或壞死成分沖洗不徹底四、免疫熒光技術(shù)將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微