高級植物生理學第5章植物鉀營養(yǎng)分子生理課件

第六章植物鉀營養(yǎng)分子生理ZichaoMaoWhypotassiumisimportantPotassium(K)playkeyrolesinphysiologicalandbiochemicalprocesses,whichgreatlyinfluencethegrowthanddevelopmentofplants.ParticularphysiologicalprocessesaffectedsubstantiallybyinadequatesupplyofK(1)partitioningofcarbohydratesbetweenrootsandshoots;(2)photosyntheticcarbonmetabolism;(3)formationofreactiveO2speciesandrelatedphotooxidation;(4)regulationofstomatalactivityandwaterregime;(5)toleranceagainstbioticandabioticstressfactors,suchassaltstressanddroughtstress.1．鉀離子是植物細胞中含量最豐富的陽離子之一。它的功能：K+能促進細胞內(nèi)酶的活性。細胞內(nèi)有50多種酶或完全依賴于K+，或受K+的激活，如丙酮酸激酶、谷胱合成酶、6-磷酸果糖激酶等能被K+激活。作用方式為：同其他一價陽離子都是通過誘導酶構象的改變，使酶得到活化，從而提高催化反應的速率。在某些情況下K+能增加酶對底物的親和力。K+對膜結合ATP酶也有激活作用。Mineralnutritionofplants-P-K-N-S-Ca-Fe-MgPlantsneedelementsotherthanCtogrowanddevelopMustintegratecarbonwithotherinorganicmineralstakenupbyrootsfromenvironmentTogether,theseelementsarethebuildingblocksofcomplexmolecules(proteins,nucleicacids,etc.)Mineral(inorganic)nutritiondependentonCmetabolismandvice-versaNeedforunderstandinghowplantsgainnutritionfromenvironmentPeoplenolongergrewtheirownfood!NeedtooptimizegrowthconditionstofeedmorepeoplecentralroleofNPKfertilizertoboostyieldHydroponicgrowthfacilitatedthediscoveryofessentialmineralnutrientsFurtherdefinitionof“essential”:Sachs(mid-19thcentury)usedhydroponicculturenowusedforvegetableproductionrootsareculturedinsolution,notinsoilMoremoderngrowthmediaHoagland’ssolution→nowslightlyMODIFIEDMurashigeandSkoog(M+S)SolutionshavehighnutrientlevelsrelativetosoilRequiredbecausethesupplyisoftennotreplenishedfrequentlyHydroponicculturecanbeassimpleasaplantsupportedinanaeratedpotIfrootswaterlogged,whathappenstoyield?CaNKSMgPFeBMnZnCuMoThereare17essentialelementsrequiredforplantgrowthWhatdefinesan“essential”element?InitsabsencetheplantcannotcompleteanormallifecycleTheelementispartofanessentialmolecule(macromolecule,metabolite)insidetheplantMostelementsfallintobothcategoriesabove(e.g.,structuralvs.enzymecofactor)These17elementsareclassifiedas9macronutrients(presentat>10mmol/kgdrywt.)8micronutrients(<10mmol/kgdrywt.)Environmental(silicon[dust])and/orcultural(fromequipment,water,impuresalts)contaminationmakeassigning“essentiality”difficultEssentialityofmicronutrients(0.1→1ug/L!)especiallydifficulttoestablishDifficulttodetectlowconcentrations→pushdetectionlimitofcommonanalyticaltechniques(e.g.,flamespectrometry)TheavailabilityofsomemineralstotheplantforgrowthisdependentonenvironmentalconditionsTheremaybehighlevelsofnutrientpresentinsoilbutitisnotinametabolicallyusefulforme.g.,FeNeedtosupplyalotDependentonpH(precipitatesoutofsolution)Fe2+morebioavailable(soluble)Manyplant“diseases”areactuallymineraldeficiencies(common:Mn,B,Cl)Someinessentialelementsarestillbeneficialtoplanthealth→requiredatsub-micronutrientconcentrationsNa(inC4plantsinvolvedintransportingCbetweenbundlesheathandmesophyllcells)Si(incellwalls;preventslodging)Co(byN-fixingbacteria)TheabsenceofessentialelementscausesdeficiencysymptomsEssentialbecauseoftheirmetabolicfunctionsCharacteristicdeficiencysymptomsshownbecauseoftheserolesTypicaldeficiencyresponsesareChlorosis:yellowing;precursortoNecrosis:tissuedeathExpressedwhenasupplyofanessentialmetabolitebecomeslimitingintheenvironmentElementconcentrationsarelimitingforgrowthwhentheyarebelowthecriticalconcentraionThisistheconcentrationofnutrientinthetissuejustbelowthelevelgivingmaximumgrowthLimitingnutrientlevelsnegativelyaffectgrowthPlantresponsestolimitingnutrientsusuallyveryvisible:affectsyield/growth!Again,chlorosisandnecrosisofleavesistypicalSometimesstraightforwardrelationshipe.g.,inchlorosis,N:chlorophyllcomponentMg:cofactorinchlorophyllsynthesisFig.12.4SometimesNOTSymptomsdependentonspeciesandnutrientmobilityCtrl-P-Ca-N-FeLet’sbrieflydiscusscellularrolesanddeficiencysymptomsforthebig3essentialelementsN:Abundantinatmospherebutmetabolicallyunavailabletonon-legumesUsuallyabsorbedasnitrate(NO3-)andreducedtoammonia(NH4+)intheplantAgronomically,Nisalwayslimiting

ThereisadirectrelationshipbetweenNsuppliedandyield!Componentofproteins,NAs(bases),PGRs,chlorophyllSymptomsofdeficiency:slowgrowth,leafchlorosisMobilizedfromolderleavestosinksassolubleamines–NH3andamidesTherefore,olderleavesshowfirstsignsAlsoaccumulateanthocyaninpigments

→becauseCskeletonscan’tmakechlorophyll,aminoacids,etc….(noN!)Thisisatypicalnutrientstressresponse!OCNCH3CH3Rostetal.“Plantbiology”,2ndednPhosphorusisthemostlimitingelementinnaturalenvironmentsP:Presentinsoilasphosphoricacid(H3PO4)pH<6.8:H2PO4-

→orthophosphate

→most

bioavailableformDeprotonatedathigherpH→lessavailablePO4tendstoprecipitateandformunavailablecomplexeswithMetalsOrganicmoleculesPresentat<1μMinmostsoils→itisthemostlimitingelementforplantgrowth!ComponentofHexose-PNucleotides(P-backbone)ATP!SymptomsofPdeficiencyincludeReducedyield,shortstemsIntensegreencolourAnthocyaninsynthesisMobilizedfromsourcestosinks(youngleaves)asforNRostetal.“Plantbiology”,2ndedn‘V’shapecomesforthalongtipandmarginofleaves.Andbrownspotsappearonoldleaves.缺鉀癥狀玉米缺鉀癥狀SmallleavesofTobaccoYellowingleavesofCabbagewhenKdefectedEtiolationfrommarginofleaf,somebrownspotsandwhitedrytissueonrapewhenpotassiumdefected.KdeficiencyKabundanceMuchflowerwhenComparisononAlmond(杏)LeavesofChestnut(栗子)

)Coloroftheflowersislight,andsomeirregularwhitespotsonsurfacesofleavesoncarnationchrysanthemumPink一、轉(zhuǎn)運途徑1．真核生物細胞膜上存在Na+--K+ATPase，高親和K+吸收轉(zhuǎn)運體和組織特異性的K+通道。2．原核生物中至少有4種功能上獨立的K+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。6.1生物膜與K離子轉(zhuǎn)運二、研究方法：膜片鉗技術它是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞上單一的（或多個的）離子通道分子活動的技術。自1980年以后，此技術已可用于很多細胞系研究。它點燃了細胞和分子水平的生理學研究的熱火，其和基因克隆技術并駕齊驅(qū)，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。這一偉大貢獻，使Neher和Sakmann獲得了1991年度諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。三、鉀的吸收形態(tài)：以離子態(tài)被植物吸收。植物吸收K+需要通過質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白(membranetransportprotein)來實現(xiàn)。1．膜轉(zhuǎn)運蛋白：載體蛋白(carrierprotein，亦稱為載體或轉(zhuǎn)運體，transporter)和通道蛋白(channelprotein)。載體蛋白與特定的離子結合，發(fā)生構象(conformation)變化，把離子轉(zhuǎn)運過質(zhì)膜。通道蛋白穿過脂雙層形成水通道。當這些通道打開時，允許特定的離子越膜通過。通道蛋白允許離子通過其所形成的水通道作被動運輸；而載體蛋白既可以與與離子相結合，順其電化學梯度進行被動運輸，也可以逆其電化學梯度進行主動運輸。2．離子的跨膜運輸：被動運輸(passivetransport)和主動運輸(activetransport)。被動運輸；由擴散作用或物理規(guī)律所決定的運輸主動運輸逆濃度梯度(reverseconcentrationgradient)或電位梯度(electricalgradient)運輸，需要消耗能量，與能量代謝相偶聯(lián)。轉(zhuǎn)運蛋白中，通道蛋白的轉(zhuǎn)運效率高1x106-8/s,。轉(zhuǎn)運體每次轉(zhuǎn)運循環(huán)只能轉(zhuǎn)運一個或幾個離子，轉(zhuǎn)運需要通過轉(zhuǎn)運蛋白的構象改變而實現(xiàn)，轉(zhuǎn)運效率低，一般轉(zhuǎn)運速度為1x103/s,三、植物對K+的吸收機制植物對K+的被動吸收主要通過K+通道完成。主動吸收通過載體蛋白來完成。植物對K+的吸收以主動吸收為主。在低濃度下吸收速率隨外界鉀濃度加大而迅速增加；當濃度較高時，增加單位濃度引起的變化減小，達到最高濃度時，鉀的吸收實際上已與鉀的濃度無關。Epstein和Hagan把離子與載體的結合看成形式上相當于酶與其底物間的關系。把載體蛋白比作酶分子，離子比作酶底物。使用不同的底物，可觀察到飽和現(xiàn)象。離子的運輸速率取決于：（1）容量因子。即當載體有效位點滿負荷時的最高運輸速度，也稱為最大運輸速率，用Vmax表示。（2）強度因子。是指在一定濃度下，載體真正負載的那部分。即“米氏常數(shù)”Km，相當于最大運輸速率50％時溶質(zhì)中離子的濃度。Km值越低，即形成最大吸收速率一半時的離子濃度越低，意味著載體場位對離子的親和力越大。當外界K+濃度范圍較高時，K+的吸收速率會大大超過低K+濃度范圍時計算的最大值。K+的高親和吸收：鉀離子以載體為媒介的轉(zhuǎn)運機制是在低濃度范圍內(nèi)活動的，即媒介載體在低濃度時起作用的，能使鉀離子仍能得到很好的吸收以滿足植物生長發(fā)育需要的機制。在高濃度K+1~50mmol/L）時的吸收屬K+的低親和吸收。高親和吸收服從簡單的Michaelis-Menten動力學方程，具有特異的選擇性。Na+或其他陽離子（Li+、Ca++、Mg++）在這個機制作用下，是不能有效地和K＋競爭的。低親和吸收受到其他陽離子（如Na+、Ca++）的干擾，不表現(xiàn)高度的專一性。為什么高親和不受其他陽離子的干擾，而低親和吸收卻會受到其他陽離子的干擾呢？四、鉀離子通道類型、特征與功能1．離子通道是跨膜蛋白每個蛋白分子能以每秒鐘106~108次的速度進行離子的被動跨膜運輸，離子在跨膜電化學勢梯度的作用下進行的運輸，不需要加入其他任何形式的自由能。電化學勢梯度包括化學勢梯度和電勢梯度兩方面，離子的運輸方向取決于這兩種梯度的大小。膜兩側(cè)的化學勢與電勢間的關系可用能斯特（Nernst）方程式表示：2．離子通道有兩個限定屬性（1）通道對離子具有選擇性，離子通道常常用通透性最高的離子或這些離子所引起的生理現(xiàn)象來命名。但是，這種選擇性也非絕對的，如有些K+通道不僅僅允許K+通透，還允許一定程度的Na+通透。確定通道對離子的選擇性順序通常有兩種方法。A．通過測量不同離子通過通道時的電導。不同離子通過通道時的電導，是一定的離子濃度和一定的膜電位條件下，離子跨膜產(chǎn)生的電流。產(chǎn)生的電流越大則對此種離子的通透性越大。B．測定不同離子存在時的反轉(zhuǎn)電位（reversalvoltage）(即離子跨膜產(chǎn)生凈電流為0時的細胞膜電位)。利用這兩種方法得出的通道對離子的選擇性順序并不一定是一致的，在很多生理條件下，它們能得出不同的選擇順序。（2）離子通道符合“有或無”法則，即它只存在“關閉”或“打開”兩種狀態(tài)（即允許離子通透或不通透）。離子濃度或跨膜電勢的變化會引起離子通道狀態(tài)發(fā)生改變，導致通道激活（activate）而打開或通道鈍化（deactivate）而關閉。3.K＋通道的類型（1）根據(jù)通道對電勢依賴性及離子流方向可分為：①內(nèi)向整流K＋通道（inward-rectifyingK＋channel：K＋in）；②外向整流K＋通道（outward-rectifyingK＋channel：K＋out）。（2）根據(jù)通道對刺激的反應快慢及對配基的依賴性可分為：①延遲的K＋通道（delayedK＋channel）；②早K＋通道（earlyK＋channel）；③Ca＋+激活K＋通道（Ca+＋activatedK＋channel）；④ATP激活的K＋通道等。在植物中主要鑒定出內(nèi)向整流K＋通道和外向整流K＋通道。這兩種通道具有不同的動力學特征，通常認為是兩種蛋白，均具有電勢依賴性。這兩種K＋通道存在于各種植物細胞膜中，如保衛(wèi)細胞、糊粉層細胞、葉片細胞、莖組織、葉肉細胞和中柱細胞等。4．植物內(nèi)向整流K＋通道（K＋in）的特征（1）位置：植物內(nèi)向整流K＋通道（K＋in）主要是存在于細胞的質(zhì)膜上，具有特殊的電勢依賴性。靜息電位是細胞質(zhì)膜內(nèi)外相對穩(wěn)定的電位差，質(zhì)膜內(nèi)電荷為負值，質(zhì)膜外為正值，這種現(xiàn)象又稱極化（polarization）。靜息電位主要是質(zhì)膜上相對穩(wěn)定的離子跨膜運輸或離子流形成的。在多數(shù)細胞中靜息電位的大小主要由Na＋和K＋在質(zhì)膜兩側(cè)不同的濃度分布來決定，質(zhì)膜對K＋的通透性大于Na＋是靜息電位產(chǎn)生的主要原因。Cl-及細胞中的蛋白質(zhì)分子（一般為靜電荷為負值）對靜息電位的大小也有一定的影響。當刺激信號（電信號或化學信號）超過一定閾值時，引起Na＋通透大大增加，瞬間大量Na＋流入細胞內(nèi)，膜電位減少乃至消失，即為質(zhì)膜的去極化過程（depolarization）。Na＋平衡電位，形成瞬間的內(nèi)正外負的激活電位，稱質(zhì)膜的反極化，激活電位隨即達到最大值。只有達到一定的刺激閾，激活電位才會出現(xiàn)。這是一種全或無的正反饋K＋通道完全打開。K＋通道是一種電壓通道，K＋流出細胞從而使質(zhì)膜再度極化，以至于超過原來的靜息電位，此時稱超極化（superpolarization）。超極化時膜電位使K＋通道關閉，膜電位又恢復靜息狀態(tài)。（2）植物內(nèi)向整流K＋通道的開啟與關閉機制：K＋in通道在細胞膜超極化（hyperpolarization）的電壓條件下被激化打開，即在跨膜電勢很低時被打開，引起胞外的K＋流入胞內(nèi)。Schoreder（1991）分離3～4周齡菜豆（V.faba）的保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體，進行全細胞膜鉗試驗發(fā)現(xiàn)，保衛(wèi)細胞原生質(zhì)膜在-100mV更負的電位及細胞外具有11.25mmol/L的K＋濃度時，K＋內(nèi)流離子通道被激活。隨著K＋濃度的降低，內(nèi)流電流減弱，當K＋濃度為0時，內(nèi)流電流消失。降低細胞外K＋濃度，激活K＋in通道所需膜電位更低。通過在不同細胞外K＋濃度條件下，測定K＋的傳導率，引入米契利斯－門藤（Michaelis-Menten）方程計算出通道對K＋的吸收動力學特征，其Km為3.5mmol/L，符合低親和K＋的吸收的特性。證明這種內(nèi)流K＋通道是對K＋濃度敏感的、依賴電壓的，對K＋親和力低的通道。這種內(nèi)流K＋通道對細胞膜電位及外界K＋的依賴性在其他作物中也已發(fā)現(xiàn)。（3）對一價陽離子吸收的選擇性：它對K＋有高度的選擇性，對一價陽離子的選擇性吸收順序為K＋>Rb+≈NH4>>Na+≈Li+>Cs+。動力學分析的Km為8mmol/L。5．植物外向整流K＋通道（K＋out）的特征（1）位置：K＋out通道存在于植物的各類細胞的質(zhì)膜中。（2）開啟與關閉機制：在細胞膜去極化（depolarization）的條件下，它被激活打開，此時的跨膜電勢比較高，導致K＋由胞內(nèi)排出到胞外。當膜電位去極化>-40mV時，K＋out通道被激活，產(chǎn)生K＋外流。Schroeder等（1987）推算每個保衛(wèi)細胞原生質(zhì)膜有近103個K＋外流通道。分離菜豆葉片下表皮保衛(wèi)細胞，進行電壓鉗位試驗，測得細胞內(nèi)K＋濃度為105mmol/L，細胞外K＋濃度為12mmol/L時，細胞的靜息電壓為-60mV，在鉗位電壓升到-40mV以上時，產(chǎn)生大量的外向電流，而在超極化電位條件下，誘發(fā)內(nèi)流電流產(chǎn)生。（3）外向整流K＋通道的種類：A.在動物細胞的質(zhì)膜上已鑒定出一系列外向整流K＋通道，稱為Shaker超家族（Shakersuperfamily）。該類型K＋通道是由4個α－亞基組成，每個亞基分子質(zhì)量約為65～100kDa之間，4個亞基上的P-區(qū)域（P-domain）排列形成通道孔（Hille1992；JanandJan1992），每一個亞基具有6個跨膜區(qū)域S1，S2，S3，S4，S5，S6。S4區(qū)域包含有幾個帶正電荷的氨基酸，對膜電壓較敏感，稱為電壓敏感區(qū)。P－區(qū)域形成通道孔的一部分，對于通道的選擇性具有非常重要的作用。動物細胞上的K＋通道也存在β－亞基，β－亞基為改變K＋通道的特性提供了新的機制，它能通過調(diào)節(jié)通道蛋白的失活來調(diào)節(jié)通道的特性；B.植物細胞中K＋通道結構與動物的K＋通道Shaker超家族結構類似，也是由α亞基組成，也存在著親水性的類似于動物的β－亞基，對通道的活性進行調(diào)節(jié)。如擬南芥中有一個KAB序列相當于動物K＋通道上的β－亞基，其分子質(zhì)量33kDa，與擬南芥K＋通道KAT的α亞基緊密結合，調(diào)節(jié)通道活性。6.2植物K＋通道的功能一、K＋通道對膜電勢的調(diào)節(jié)不同方式的物質(zhì)跨膜運動，其結果是產(chǎn)生維持了膜兩側(cè)不同的物質(zhì)濃度梯度。對離子來說，就形成了膜兩側(cè)的電位差。玻璃微電極插入細胞可測出細胞質(zhì)膜兩側(cè)的各種帶電物質(zhì)形成的電位差的總和，即膜電位。這類測定首次是在巨型藻類細胞中進行的，檢出的細胞膜負電勢高達-100～-200mV。細胞膜電位種類：一種稱為靜息電位（restingpotential），在該電位條件下，沒有離子的轉(zhuǎn)運；另一種是激活電位（activepotential），即在刺激作用下產(chǎn)生并行使通訊功能的快速變化的膜電位。二、Na＋－K＋泵對靜息電位相對恒定也有重要的作用因為Na＋－K＋泵能維持細胞內(nèi)高K＋低Na＋的內(nèi)部環(huán)境，使細胞具有相對穩(wěn)定的膜電位。Na＋－K＋泵的組成：它由α和β兩個亞基組成，α亞基的分子量為120kDa,是一個跨膜多次的整合膜蛋白，具有ATP酶活性。β亞基分子質(zhì)量為50kDa,是一種具有組織特異性的糖蛋白。Na＋－K＋泵的工作模式：在細胞內(nèi)側(cè)α亞基與Na＋相結合促進ATP水解，α亞基上一個天門冬氨酸殘基磷酸化引起β亞基構象發(fā)生變化，將Na＋運出細胞，同時細胞外的K＋與β亞基的另一個位點結合，使其去磷酸化，β亞基構象再度發(fā)生變化將K＋輸入細胞，完成了整個循環(huán)。每個循環(huán)消耗一個ATP分子，轉(zhuǎn)運3個Na＋和2個K＋。綜上所述，膜電位與質(zhì)膜對K＋和Na＋的不同透性有關，而且質(zhì)膜上的Na＋、K＋通道蛋白及Na＋---K＋泵等膜蛋白隨膜電位變化有規(guī)律地關啟。6.3K＋通道與植物K＋營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)運一、植物根系對K＋的吸收轉(zhuǎn)運有兩種機制高親和K＋吸收（highaffinityK＋uptake）與低親和K＋吸收（lowaffinityK＋uptake）(MaathuisandSanders1996)。高親和K＋吸收主要依靠轉(zhuǎn)運體來完成，是一種主動吸收過程。低親和K＋吸收主要通道K＋內(nèi)流通道完成。K＋通道蛋白對K＋吸收的Km為3～16mmol/L，細胞外界K＋濃度≥300μmol/L。Findlay和Gassmann于1994年分別在小麥根毛和表皮細胞中觀察到典型的K＋in通道電流，其Km為8.8mmol/L。這與低親和K＋吸收動力學特性相一致。研究發(fā)現(xiàn)小麥根毛中的K＋in通道能被Al3＋所抑制（Gassmann1994）。鋁對植物毒害的主要生理機制是抑制根的生長，影響根系對陽離子的吸收。鋁抑制K＋in通道，從另一方面也證明了K＋in通道是低親和K＋吸收的主要途徑。二、K＋in通道對離子吸收具有兩種功能①K＋in通道為低親和K＋吸收提供了一條途徑，其吸收過程受H＋-泵建立的跨膜電勢的驅(qū)動；②K＋in通道通過感受胞外與胞內(nèi)之間的K＋濃度梯度，調(diào)整膜電導而控制溶質(zhì)的跨膜運輸，影響其他運輸系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。6.4K＋通道與木質(zhì)部的運輸植物根系吸收的養(yǎng)分到達地上之前需要被轉(zhuǎn)運到木質(zhì)部。木質(zhì)部導管周圍的木薄壁細胞中的質(zhì)子泵、水通道和離子通道對離子或溶質(zhì)在木質(zhì)部的載入和卸出起著重要作用。大麥的木薄壁細胞質(zhì)膜中有三類陽離子通道。外向整流傳導的K＋通道（KORCK+：outward-rectifyingconductance，等于K＋out通道）、非選擇性外向整流傳導K＋通道（NORC：nonselectiveoutward-rectifyingconductance）及內(nèi)向整流傳導K＋通道（KIRC：K＋inward-rectifyingconductance，等于K＋in通道）。KORC及NORC通道負責離子載入木質(zhì)部，分別在跨膜電勢高于-50和+30mV時被激活。NORC通道對陽離子無選擇性，與胚乳細胞中描述的外向整流通道類似（StoeckelandTakeda1989）。KORC和NORC通道能共同存在于同一個細胞中，它們的激活都依賴于胞內(nèi)Ca2＋水平。根系中，當質(zhì)子泵的活力減少和（或）陰離子通道激活引起陰離子釋放到木質(zhì)部時，導致膜的去極化，激活K＋out通道，K＋out通道將K＋釋放出到木質(zhì)部。在以上描述K＋通道作用時，我們都沒有考慮植物細胞中的液泡對生理過程的影響。液泡作為植物細胞的一個重要組成，它積累了胞內(nèi)95％的K＋

，是細胞膨脹和萎蔫的結構基礎。在大多數(shù)情況下，液泡對K＋的吸收是主動運輸，而液泡內(nèi)K＋的釋放被認為是由K＋通道調(diào)整的。已經(jīng)證明液泡膜中存在有三種K＋通道：（1）SV（slow-activatedvacuolar）通道它對陽離子無選擇性，允許K＋進入液泡；（2）是VK(vacuolarK＋

)通道它對K＋具有高度的選擇性，并且是電勢依賴型的通道。VK通道能引起K＋由液泡內(nèi)向胞質(zhì)中釋放；（3）FV（fast-activatedvacuolar）通道與SV通道類似，對陽離子無選擇性，主要引起陽離子從液泡向胞質(zhì)中釋放，并提高胞質(zhì)部分的滲透壓。這些通道使得胞內(nèi)部分成為一個整體，直接對外部刺激反應。綜上所述，K＋通道在高等植物中參與大量的生理反應過程。其中，K＋

in通道的功能可概括為：1）在保衛(wèi)細胞及不同類型植物細胞的膨脹、運動和生長過程中介導的K＋的吸收。2）通過在根細胞上形成一種低親和性的吸收途徑進行K＋的營養(yǎng)吸收和運輸。3）將陽離子從木質(zhì)部釋放到共質(zhì)體中。4）進行跨膜電勢的調(diào)整，如阻止膜的過度超極化。K＋out通道的功能可概括為：1）進行跨膜電勢的調(diào)整，如阻止膜的過度去極化。2）釋放溶質(zhì)行使生理功能，如造成氣孔的關閉、組織運動和滲透壓的調(diào)整等。3）陽離子載入木質(zhì)部。6.3植物K＋營養(yǎng)的高親和吸收特性一、K＋／H＋的協(xié)同完成K＋的運輸植物細胞通常處于低K＋的環(huán)境條件下（在μmol/L范圍內(nèi)），在此條件下植物細胞質(zhì)膜依靠高親和K＋轉(zhuǎn)運系統(tǒng)吸收外界環(huán)境中的K＋。高親和K＋轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要由高親和K＋轉(zhuǎn)運蛋白組成。二、K＋／Na＋共轉(zhuǎn)體作用影響K＋的吸收Rubio（1995）研究HKT1對K＋吸收的分子機制指出，K＋的吸收也是在K＋／Na＋共轉(zhuǎn)體作用下進行的，HKT1有兩個離子結合位點，一個是K＋結合位點，一個是Na＋結合位點。HKT1對K＋是高親和吸收（Km為3μmol/L），對于Na＋是低親和吸收（Km為175μmol/L），當Na＋濃度過高時會抑制K＋的吸收，即Na＋與K＋競爭與通道蛋白K＋結合位點。這表明HTK1是一個對堿性陽離子非選擇性吸收的雙向轉(zhuǎn)運蛋白。因此，在高鹽濃度下，植物會受到鈉鹽的毒害。6.4模式真核生物酵母的K轉(zhuǎn)運的研究一、酵母K＋吸收轉(zhuǎn)運功能缺失突變體的分離鑒定1．K＋吸收轉(zhuǎn)運機制：①低親和K＋吸收轉(zhuǎn)運（Km為2mmol/L）。細胞在2mmol/LK＋濃度范圍內(nèi)生長K＋吸收轉(zhuǎn)運體進行，最大吸收速率為7nmol/(mg.min)。②高親和K＋吸收轉(zhuǎn)運（Km為24μmol/L）,在K＋缺乏條件下K＋吸收依賴高親和轉(zhuǎn)運，最大吸收速率為34nmol/(mg.min)（Rodriguezetal.1984；Andersonetal.1995）。2．功能突變體的分離及鑒定：Ramos等（1985）用EMS（ethylmethanesulfonate）處理酵母細胞株系XT3000.3A（MATα,ade2-1）,篩選高親和K＋吸收轉(zhuǎn)運體基因缺失突變體（能在100mmol/LK＋介質(zhì)中生長，不能在1mmol/LK＋中生長的細胞）。由此篩選到的一個突變體記為PC-1。在精氨酸磷酸鹽培養(yǎng)介質(zhì)中，兩者生長達最大速度一半時，需K＋濃度相差兩個數(shù)量級，野生型及突變體的需K＋量分別為2μmol/L及3mmol/L。當野生型及突變體保持相同的生長率時，盡管需要的生長介質(zhì)中K＋的濃度不同，但細胞內(nèi)K＋的含量相似。隨著胞外K＋的濃度降低，細胞的生長速率降低，細胞內(nèi)K＋的含量也降低。二、酵母高親和K＋吸收轉(zhuǎn)運基因trki的分離鑒定酵母細胞內(nèi)外K＋濃度差異可達1000倍，如酵母細胞在5μmol/LK＋的介質(zhì)中生長，細胞內(nèi)K＋的水平可達到近150nmol/L（Bost1981）。這種現(xiàn)象說明酵母細胞質(zhì)膜上存在著產(chǎn)生和維持K＋濃度梯度的蛋白。已發(fā)現(xiàn)在酵母細胞質(zhì)膜上存在質(zhì)子泵(Serrno1984)，至少一類K＋通道和負責K＋吸收的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。他們之間的關系需要進一步鑒定，但有證據(jù)表明它們在功能上是相互獨立的。在K＋脅迫下，通過體外得到驅(qū)動質(zhì)子跨膜和ATP-ADP交換的質(zhì)子泵H+-ATPase；鑒定到酵母K＋高親和轉(zhuǎn)運體基因trkl.

酵母K＋吸收轉(zhuǎn)運功能缺失的突變體不能在低K＋的介質(zhì)中（1mmol/L）生長。野生型細胞達最大生長率需介質(zhì)K＋濃度小于1mmol/L，突變體trk1-1達最大生長速率需介質(zhì)K＋濃度為5～10mmol/L。用野生型酵母基因組克?。嫿ㄓ诖┧筚|(zhì)粒YCp50）轉(zhuǎn)化突變體，凡能使突變體恢復在低K＋介質(zhì)中生長的克隆，便是包含有高親和K＋吸收轉(zhuǎn)運體基因trk1的克隆----（功能互補）。含trk1基因的4.2kb堿基序列分析表明，trk1基因閱讀框有3705bp。編碼1235個氨基酸的多肽，分子質(zhì)時141kDa。該蛋白共包含有12個由20～22個疏水氨基酸組成的跨膜結構區(qū)，N末端的40個氨基酸也組成一個疏水性結構，但似乎不組成跨膜結構。TRK1蛋白序列1044～1058的氨基酸序列：NNNNNNNRKKKKKKK和第1500～1545的氨基酸序列：DMDDDDDDDDNDGD形成了trk1表達蛋白的兩個高度帶電荷區(qū)域，可能形成對電壓敏感區(qū)。沒有發(fā)現(xiàn)TRK1蛋白氨基酸序列與任何其他蛋白有大范圍的同源序列，但是與一些小而有重要意義的蛋白氨基酸序列同源。TRK1與加利福尼亞魚雷（torpedocalifornica）的乙酰膽堿受體α－亞基的氨基酸序列，大腸肝菌kdpC基因編碼的K＋轉(zhuǎn)運ATPase酶的氨基酸序列有部分同源性。在乙酰膽堿受體α－亞基的20個氨基酸序列中有7個氨基酸組分與TRK1同源，這7個同源氨基酸包括不常見的色氨酸和兩個相鄰的組氨酸殘基。大腸桿菌K＋轉(zhuǎn)運ATPase的22個氨基酸序列中也有7個氨基酸與TRK1同源。這兩種蛋白都涉及到陽離子的轉(zhuǎn)運。TRK1與它們有同源性具有非常重要的意義。TRK1與其他許多原核或真核生物的核苷酸結合蛋白具有同源性，如TRK1的第735～739氨基酸GSGKT與其他核苷酸結合蛋白具有4～5個相同氨基酸殘基。這一結構中的Gly是非常保守的，在所有比較的序列中，序列GXXGXGKT除UvrD（大腸桿菌的一種蛋白）和Ef－G（大腸桿菌的一種蛋白）外，各蛋白間高度保守。氨基酸親和性作圖分析（hydropathyplot）表明TRK1有12個疏水片段，可形成12個跨膜結構。位于S3和S4之間有一段650個氨基酸長度的親水區(qū)。雖然此部分含有80％的TRK1蛋白甲基化位點，到目前為止還沒有實驗方法證明該親水區(qū)是胞內(nèi)的還是胞外的。其他蛋白，如細菌ATPase和乙酰膽堿受體的650個氨基酸長度的親水區(qū)通常認為是胞內(nèi)的。根據(jù)TRK1的氨基酸序列及其親水性作圖分析，推測TRK1的蛋白結構模型。TRK2是基因組分析出的確TRK1同源基因，突出物可能是起源于同一祖先或是由于基因重復造成的。TRK1與TRK2兩者在結構上存在以下差異：1)TRK1的S3與S4之間有650個親水氨基酸，而TRK2減少為334個氨基酸，而且在這一區(qū)域兩者的氨基酸序列幾乎不相關。2)TRK1從1040氨基酸位開始有27個親水氨基酸，而TRK2卻減少為7個。3)TRK2比TRK1的羧基端少13個氨基酸。4)TRK1中位于S3和S4之間的一個假設的核苷酸結合區(qū)GSGKT，TRK2缺失與TRK1完全不同。5)TRK1的14個糖基化位點在TRK2中只有兩個（606～801）。6)TRK1的10個半胱氨酸，在TRK2僅有4個（分別位于第463，584，760，762個氨基酸位置）。這表明TRK1與TRK2雖是非常相似的K＋轉(zhuǎn)運蛋白，但結構上的細微差異，決定了其功能上的不同。通過K＋吸收缺陷型酵母細胞的功能互補法（functionalcomplemention），從擬南芥中克隆出兩類不同的K＋通道cDNA，分別被命名為akt1和kat1(Andersonetal.1992；Sentenacetal.1992)。根據(jù)這兩個基因編碼的蛋白氨基酸序列及蛋白結構上的一些特征，人們推測AKT1和KAT1是“Shaker”超家族（“Shaker”superfamily）的成員。對AKT1和KAT1的測序結果表明，它們有6或7個跨膜結構域。在第5和第6個跨結構域處有一個P-區(qū)域，它被用來組成離子通道的通道孔，其上還帶有離子通透所需的結合位點。S跨膜區(qū)上有一些堿性的氨基酸殘基，它們以每隔兩個氨基酸殘基位置的規(guī)律進行排布，由于這些氨基酸殘基上所帶的正電荷形成電壓傳感器（voltagesensor），它們是通道對跨膜電勢的變化進行反應所必需的結構。KAT1及AKT1與動物細胞上的去極化激活的K＋out通道結構類似，但通過KAT1和AKT1在爪蟾卵母細胞（Schachtmanetal.1992）和酵母細胞中的（Bertletal.1994）表達研究，及細胞電壓鉗位試驗研究，發(fā)現(xiàn)這兩個通道蛋白均為K＋in通道。9.3高等植物K＋吸收轉(zhuǎn)運基因及表達高等植物K＋吸收轉(zhuǎn)運也有高親和與低親和兩種系統(tǒng)。目前已從擬南芥中克隆K＋in通道（Caoetal.1995,Mulleretal.1995）與K＋out通道基因(Czempinskietal.1997)；從馬鈴薯中克隆了K＋in通道基因(KetchumandSlayman1996)。擬南芥的K＋out通道KCO1已在昆蟲細胞中得到表達(Czempinskietal.1997)，這種通道對細胞中游離Ca＋濃度具有很大的依賴性，屬于一類新的通道，被稱為“兩孔”通道(“two-pore”channel)的成員(Ketchumetal.1995,Kochian1993)。從小麥根尖已分離到K＋高親和吸收轉(zhuǎn)運體基因hkt1。一、擬南芥K＋in通道基因KAT1用擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母雙缺失突變體(trk1⊿trk2⊿)，發(fā)現(xiàn)了使突變體恢復在有限的K＋介質(zhì)中生長的克隆KAT1（Andersonetal.1992）。KAT1閱讀框有2031個核苷酸，編碼677個氨基酸，分子質(zhì)量78kDa。水合性作圖分析的（hydropathyplot）推測該蛋白可能有7個跨膜結構，其中有6個結構成串排列在多肽的N端，這一結構是所有電壓敏感Shaker家族K＋通道的結構特征。比較KAT1與Shaker族的K＋通道的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其同源性低于20％，但6個跨膜區(qū)同源性較高。特別是在高度保守區(qū)具有相同的氨基酸。如電壓敏感區(qū)（S4）及形成通道孔的區(qū)域（H5）。S4區(qū)位于第三（S3）和第五（S5）跨膜區(qū)之間。其序列中每隔3～4個氨基酸存在一個疏水性的賴氨酸或精氨酸等堿性氨基酸。KAT1的162～180位的氨基酸序列組成S4區(qū)，與Shaker族的K＋通道的相應區(qū)段氨基酸序列相比，變化主要在第168和176位氨基酸分別為絲氨酸。位于S5和S6區(qū)之間的H5區(qū)，與其他動物K＋通道同源性很高，尤其是第259和260個氨基酸為蘇氨酸。蘇氨酸被認為在離子選擇吸收方面起重要作用（Yellenetal.1991;Yooletal.1991）。KAT1通道對一價陽離子的傳導率離子K+78Rb+Na+Cs+Li+NH4+K+傳導率的%10028±137±89±116±330±12測定的卵母細胞數(shù)目25544311KAT1轉(zhuǎn)化到酵母細胞的表達特性出表明，KAT1是一種內(nèi)流通道蛋白。對酵母野生型株系Y588、雙缺失突變體trk1⊿trk2⊿CY152／CY162、pRS316載體轉(zhuǎn)化的雙缺失突變體CY162/pRS316及KAT1轉(zhuǎn)化的雙缺失突變體CY162－pKAT1四類細胞進行全細胞模式電壓鉗位試驗，發(fā)現(xiàn)雙缺失株系突變體在任何電壓條件下沒有內(nèi)流電流發(fā)生，野生型細胞有較小內(nèi)流電流發(fā)生（在-200mV時僅為-50pA），而轉(zhuǎn)化細胞發(fā)現(xiàn)有一個大的緩慢激活的內(nèi)流電流產(chǎn)生，pRS316載體轉(zhuǎn)化的雙缺失突變體CY162／pRS31沒有內(nèi)流電流發(fā)生。將KAT1轉(zhuǎn)化體及載體轉(zhuǎn)化體的電壓鉗位試驗結果繪制電流－電壓曲線，同時將細胞外150mmol/LKCl取代成10mmol/LKCl及200mmol/L山梨醇，發(fā)現(xiàn)有kat1的細胞內(nèi)流電流的大小依賴于細胞外的K＋濃度。用NH4＋或Na＋取代細胞外的K＋,研究KAT1轉(zhuǎn)化的酵母細胞中KAT1通道的陽離子選擇性吸收發(fā)現(xiàn)，150mmol/LNH4＋或Na＋取代介質(zhì)中150mmol/LKCl后，內(nèi)流電流分別下降15％和5％，K＋／NH4＋，K＋／Na＋滲透率分別為8和20左右。3．將KAT15?啟動子與GUS基因融合（KAT1：：GUS）轉(zhuǎn)移到擬南芥中。在所有11個轉(zhuǎn)基因植株中，GUS基因表達活性最高的是下胚軸、子葉及7～12天幼苗的保衛(wèi)細胞中，在只轉(zhuǎn)入載體的植物中，沒有發(fā)現(xiàn)GUS表達活性（Nakamuraetal.1995）。在11個轉(zhuǎn)基因植物系中有2個系。發(fā)現(xiàn)GUS在根的維管組織有表達，但在根中的表達比在氣孔部位的表達弱，這可能是氣孔過多的GUS表達物轉(zhuǎn)運到根，并在根中積累，或者GUS在根中有弱表達。KAT1主要在植物的保衛(wèi)細胞中表達可能與KAT1通道與氣孔的運動有關。三、擬南芥K＋通道基因AKT2的結構及表達將AKT1cDNA克隆AccI酶切的1.6kb片段,及其KAT1的PCR片段(這些片段包括了6個跨膜片段)進行32PdATP標記，在低強度條件下，篩選擬南芥的cDNA文庫，從5×104噬菌體克隆中，篩選到3個陽性克隆。序列分析發(fā)現(xiàn)由兩個分別為KAT1和AKT1，另外有一個新克隆，命名為AKT2。AKT2基因的發(fā)現(xiàn)，證明了植物K+通道像動物K通道一樣，也是以基因家族存在的,是植物產(chǎn)生不同K+通道的機制，也反映了植物的多種適應性。Cao等人(1995)研究擬南芥AKT2的cDNA序列及其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，AKT2基因編碼由802個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為91.3kDa，親水性分析推測AKT2多肽序列有6個可能的跨膜結構，分別為S1，S2，S3，S4，S5，S6和一個H5區(qū)，包含有6個糖基化位點和15個磷酸化位點。氨基酸的糖基化位點和磷酸化位點是跨膜蛋白的特有特征。AKT2蛋白的第415至498個氨基酸其他許多蛋白的環(huán)核苷酸結合區(qū)域同源，如與蝗蟲EAG通道，環(huán)核苷酸門控通道及大腸桿菌降解物基因激活通道具有同源性。在AKT2蛋白的環(huán)腺苷酸結合區(qū)域的下游有5個32~33個氨基酸的重復序列，每一重復都有錨蛋白重復的特點，因為在錨蛋白及包含有錨蛋白重復的蛋白中，都有一個以33個氨基酸為一個單元的結構多次重復出現(xiàn)。錨蛋白重復結構可能通過與細胞骨架因素結合或與其他蛋白結合來決定通道蛋白的位置或通道蛋白的功能。