酵母細(xì)胞固定化技術(shù)

酵母細(xì)胞固定化技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞固定化的原理和方法學(xué)習(xí)和掌握酵母細(xì)胞固定化的方法固定化細(xì)胞技術(shù)：用物理或者化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性，可以反復(fù)使用的方法。應(yīng)用：1、應(yīng)用于食品、化學(xué)、醫(yī)藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等。2、應(yīng)用于生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物，包括酒精酒類，氨基酸，有機(jī)酸，酶，輔酶，抗生素，甾體轉(zhuǎn)化，廢水處理。3、用于制造微生物傳感器。方法：①吸附法（載體結(jié)合法）原理：根據(jù)帶點(diǎn)的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電，表面張力和粘附力的作用，使細(xì)胞固定在表面和內(nèi)部優(yōu)缺點(diǎn)：簡便，活力損失小，但細(xì)胞和載體作用力小，易脫落定義：將酶（或細(xì)胞）吸附在載體表面上②包埋法：定義：將酶（或細(xì)胞）包埋在多孔的

水不溶性載體的緊密結(jié)構(gòu)中，使其處于活化狀體類型：a、凝膠包埋法b、半透明包埋法原理：a、將細(xì)胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微控中而使細(xì)胞固定b、將細(xì)胞包埋在各種高分子聚合物制成的小球里優(yōu)點(diǎn)：簡單、條件溫和、穩(wěn)定性好、活性高，包埋細(xì)胞容量高，活力持久。（是最常用，最有效的方法）交聯(lián)法：③定義：將酶（或細(xì)胞）相互連接起來（化學(xué)結(jié)合法）原理：利用雙功能或多功能試劑，直接與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞，其結(jié)合力是共價(jià)鍵。優(yōu)缺點(diǎn)：制備麻煩，活力損失較大，但細(xì)胞與載體結(jié)合較緊④共價(jià)結(jié)合法原理：細(xì)胞表面上功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，從而使細(xì)胞固定。優(yōu)缺點(diǎn)：結(jié)合緊密，不易脫落，但制備較難，且活力損失較大載體1、多糖類：纖維素，瓊脂，葡萄糖凝膠，藻酸鈣，K-角叉膠等2、蛋白質(zhì)：骨膠原，明膠等3、無機(jī)載體：氧化鉛，活性炭，陶瓷，磁鐵，SiO2，磷酸鈣凝膠等4、合成載體：聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，酚醛樹脂5、多孔載體：海藻酸鹽實(shí)驗(yàn)中以海藻酸鹽，角叉膠和聚丙烯酰胺最為常用海藻酸鹽優(yōu)點(diǎn)：1、具有化學(xué)穩(wěn)定性好2、無毒3、包埋效率高且價(jià)格低廉缺點(diǎn)：包埋時(shí)，凝膠顆粒容易破損，軟化等，穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度較差，不利于固定化細(xì)胞的多次利用本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本次實(shí)驗(yàn)采用以海藻酸鹽為例，運(yùn)用包埋法介紹酵母細(xì)胞的固定化方法。實(shí)驗(yàn)材料與試劑菌種：釀酒酵母培養(yǎng)基：2%蔗糖培養(yǎng)基試劑：含10%葡萄糖溶液的0.05mol/LCaCI2溶液，海藻酸鈉，無菌水器材：小燒杯，平皿，試管，無菌的錐形瓶，無菌吸管實(shí)驗(yàn)流程第一階段：酵母細(xì)胞的活化第二階段：細(xì)胞固定化第三階段：固定化酵母的發(fā)酵第四階段：酒精的檢驗(yàn)酵母細(xì)胞的活化在缺水的狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)，活化就是要讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)，酵母細(xì)胞所需要的活化時(shí)間較短，一般需要0.5-1h。細(xì)胞固定化1、稱取海藻酸鈉0.4g置于無菌燒杯中，加無菌水少許調(diào)成糊狀，再加夠10ml水，適當(dāng)加熱溶解。2、將溶好的海藻酸鈉溶液冷卻到45℃左右，加入預(yù)熱至35℃左右的酵母細(xì)胞液，混合均勻，用無菌的吸管吸取混合液，逐滴加入預(yù)先盛有100ml含10%葡萄糖的0.05mol/LCaCI2溶液，使其成為凝膠珠，靜置30min。3、待凝膠珠在溶解中浸泡30min后,用無菌水洗滌三次后加入2%蔗糖培養(yǎng)基中，置25℃下發(fā)酵7-9d，發(fā)酵結(jié)束后測定其酒精的含量。酒精的檢測方法：用蒸餾法蒸餾出乙醇水容易，再用酒精計(jì)測量其究竟度數(shù)。注意事項(xiàng)加入海藻酸鈉是操作中最重要的一環(huán)，涉及到實(shí)驗(yàn)的成敗，濃度過高：難以形成凝膠珠；太低，形成的凝膠珠所包埋的酵母數(shù)量少，影響實(shí)驗(yàn)效果。剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時(shí)間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。檢驗(yàn)?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下來方法：1、用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，看有沒液體流出。2、用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易弾起，表明制備的凝膠珠成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論觀察凝膠珠的顏色和形狀

①如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗。②如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，