微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)第一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日微生物的類(lèi)群原生生物原核生物真菌病毒如酵母菌單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲(chóng)、單細(xì)胞藻類(lèi)等微生物包含了除植物界和動(dòng)物界以外的所有生物無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞第二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專(zhuān)題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日課題背景19世紀(jì)中期，關(guān)系到法國(guó)經(jīng)濟(jì)命脈的釀造業(yè)曾一度遭受毀滅性的打擊。在生產(chǎn)過(guò)程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過(guò)一番研究，法國(guó)科學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們意識(shí)到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應(yīng)用微生物的前提。一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無(wú)處不在的其他微生物無(wú)法混入。第四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）培養(yǎng)基

人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。1.培養(yǎng)基的類(lèi)型（1）按物理狀態(tài)來(lái)分：

固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基（2）按成分來(lái)分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基（3）按功能來(lái)分：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基(微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))第五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不明確的天然有機(jī)物用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分明確的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基用于分類(lèi)和鑒定分類(lèi)第六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏進(jìn)行觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類(lèi)鑒定大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究第七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來(lái)將某種或某類(lèi)微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基用于鑒別不同類(lèi)型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)第八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日微生物需要的四大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)要素物質(zhì)（二）培養(yǎng)基的構(gòu)成1.碳源2.氮源3.無(wú)機(jī)鹽4.水凡是能為微生物提供所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。⑴概念：⑵不同微生物所利用的碳源不同：1.微生物的碳源異養(yǎng)型微生物的碳源為：含碳有機(jī)物（有機(jī)碳）自養(yǎng)型微生物的碳源為：含碳無(wú)機(jī)物（無(wú)機(jī)碳）第九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日①無(wú)機(jī)氮源②有機(jī)氮源凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁㎞元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.微生物的氮源⑴概念：⑵來(lái)源：⑶固氮微生物所利用的氮源是：3.特殊要求培養(yǎng)基還需要滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)的pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

例如:生長(zhǎng)因子：微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物維生素、某些氨基酸、堿基氮?dú)獾谑?yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日1000mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基組分提供的主要營(yíng)養(yǎng)牛肉膏5.0g碳源、氮源、磷酸鹽和維生素蛋白胨10.0g氮源和維生素NaCl5.0g無(wú)機(jī)鹽H2O

定容至1000ml氫元素、氧元素牛肉膏當(dāng)中含有肌酸、肌酸酐、多肽類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核苷酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、礦物質(zhì)類(lèi)及維生素類(lèi)。的水溶性物質(zhì)。牛肉膏為微生物提供碳源、氮源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素。第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)基配制原則：（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類(lèi)、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類(lèi)，因?yàn)椴煌奈⑸飳?duì)培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長(zhǎng)的pH范圍不同。細(xì)菌pH為：（中性或微堿性）；放線菌pH為：；真菌pH為：（偏酸型）。第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日二、無(wú)菌技術(shù)1.無(wú)菌技術(shù)

（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。（3）為避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲废嘟佑|。無(wú)菌技術(shù)，主要包括以下幾個(gè)方面：第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日消毒：指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。2.消毒與滅菌

滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而達(dá)到完全無(wú)菌的過(guò)程。提示：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。討論2：無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min化學(xué)藥劑消毒法:用70%酒精進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源紫外線消毒(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日1、灼燒滅菌---接種工具的滅菌(2)滅菌的方法：第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日2、干熱滅菌：

160-170℃下加熱1-2h。主要對(duì)能耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金屬用具等進(jìn)行滅菌。3、高壓蒸氣滅菌：

100kPa、121℃下，維持15-30min。培養(yǎng)基滅菌。第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日討論3：請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手提示：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：（根據(jù)微生物生長(zhǎng)時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求）物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.稱(chēng)量

準(zhǔn)確稱(chēng)取各種成分，注意事項(xiàng)：牛肉膏要放在稱(chēng)量紙上稱(chēng)量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速，稱(chēng)后及時(shí)蓋上瓶蓋。三、實(shí)驗(yàn)操作思考：該培養(yǎng)基從物理性質(zhì)分屬于哪種？原因？含有幾種營(yíng)養(yǎng)成分？牛肉膏提供上述哪幾種成分？第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

3.溶化：

先將牛肉膏連同稱(chēng)量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱(chēng)量紙分離后，用玻璃棒取出稱(chēng)量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，不斷用玻璃棒攪拌，原因：防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。待溶解后，加自來(lái)水定溶至100mL。（熔化后滅菌前應(yīng)該調(diào)節(jié)PH)

4.滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3～5套，用幾層報(bào)紙包好）一起放到高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌。

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時(shí)倒平板。第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日倒平板技術(shù)第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問(wèn)題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日（二）純化大腸桿菌：1.純化的方法：（1）平板劃線法：

通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫(huà)線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，在數(shù)次畫(huà)線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。（2）稀釋涂布平板法：

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋?zhuān)缓髮⒉煌♂尪鹊木悍謩e涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)棉塞將試管口通過(guò)火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。.將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日微生物的恒溫培養(yǎng)第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日平板劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基的原因：一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日問(wèn)題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

2.稀釋涂布平板法將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋?zhuān)缓髮⒉煌♂尪鹊木悍謩e涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。

在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。稀釋涂布平板法操作過(guò)程分兩個(gè)步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日系列稀釋操作101102103104105106

(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號(hào)。

(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。

(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復(fù)步驟2，直至到第六支試管。第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日將涂布器浸在盛有70％酒精的燒杯中取少量（不超0.1mL）稀釋液滴加到培養(yǎng)基表面灼燒待酒精燃盡后冷卻8～10s

涂布將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻涂布平板操作第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日稀釋涂布平板法獲取的菌落第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日（三）菌種的保存擱置斜面

1.試管低溫臨時(shí)保藏將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6個(gè)月要重新接種培養(yǎng)后再保存）。

2.甘油管長(zhǎng)期保藏在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷凍箱中保存。第三十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日四、課題