第八章反膠團(tuán)萃取

第八章反膠團(tuán)萃取概述反膠團(tuán)的形成反膠團(tuán)的理化特性及制備反膠團(tuán)萃取的原理在分離工藝中的應(yīng)用概述1.概念反膠團(tuán)(ReversedMicelles)是兩性表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中親水性基團(tuán)自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴，空間尺度僅為納米級(jí)的集合型膠體。反膠團(tuán)的兩個(gè)特異性功能（1）具有分子識(shí)別并允許選擇性透過(guò)的半透膜的功能：（2）在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性的功能。反膠團(tuán)萃取在分離蛋白中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性;(2)分離和濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過(guò)程簡(jiǎn)便;（3）能解決蛋白質(zhì)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問(wèn)題；（4）由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑具有細(xì)胞破壁功能，所以可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；（5）反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。反膠團(tuán)的構(gòu)造當(dāng)向非極性溶劑中加入表面活性劑時(shí)，如表面活性劑的濃度超過(guò)一定的數(shù)值時(shí)，在非極性溶劑中表面活性劑聚集成團(tuán)，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中行成的微膠團(tuán)方向相反，因而稱為反膠團(tuán)。反膠團(tuán)體系的分類

1、單一表面活性劑反膠團(tuán)體系

研究得最多的是陰離子型ＡＯＴ,該體系結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和穩(wěn)定,反膠團(tuán)體積相對(duì)較大,適用于等電點(diǎn)較高的較小相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離,其次有ＤＯＬＰＡ(二油基磷酸)。另一類是陽(yáng)離子表面活性劑,如ＣＴＡＢ(溴代十六烷基三甲銨),ＴＯＭＡＣ（氯化三辛基甲銨）,ＤＡＰ(十二烷基丙酸銨),ＤＤＡＢ(二十二烷基二甲基溴化銨)等。該體系適用于等電點(diǎn)較低的較大相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離。而非離子型表面活性劑能構(gòu)成更大的反膠團(tuán),但這類體系容易乳化。一般在使用時(shí)無(wú)須加入助劑的表面活性劑具有多條中等長(zhǎng)度的烷基尾和一個(gè)較小的極性頭,如ＡＯＴ,ＤＤＡＢ有二條疏水尾,而ＴＯＭＡＣ有三條疏水尾。

2、混合表面活性劑反膠團(tuán)體系

這是指兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的體系,一般來(lái)說(shuō),混合表面活性劑反膠團(tuán)體系對(duì)蛋白質(zhì)有更高的分離效率。例如將ＡＯＴ與ＤＥＨＰＡ(二-(2-乙基己基)磷酸)構(gòu)成的混合體系,可萃取相對(duì)分子質(zhì)量較大的牛血紅蛋白,萃取率達(dá)80%。其他,如ＡＯＴ/ＤＯＬＰＡ,ＡＯＴ/Ｔｗｅｅｎ85體系對(duì)蛋白質(zhì)的萃取能力都優(yōu)于單一的ＡＯＴ體系。非離子表面活性劑的加入可使反膠團(tuán)變大,從而可萃取相對(duì)分子質(zhì)量更大的蛋白質(zhì)。

3、親和反膠團(tuán)體系

這是指體系中除了有組成膠團(tuán)的表面活性劑外,還有具有親和特性的助劑,它的親和配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)有特異的結(jié)合能力,往往極少量親和配基的加入就會(huì)使萃取蛋白質(zhì)的選擇性大大提高。例如,以一種三嗪藍(lán)染料ＣＢ(ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ3ＧＡ)為親和配基,極少量的加入ＣＴＡＢ體系后,可以萃取原來(lái)不被萃取的牛血清白蛋白。

影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素

1水相ｐＨ值的影響

表面活性劑的極性頭朝向反膠團(tuán)內(nèi)部,使反膠團(tuán)的內(nèi)壁帶有一定的電荷。而蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì),水相的ｐＨ值決定了蛋白質(zhì)分子表面可電離基團(tuán)的離子化程度,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶的電荷與反膠團(tuán)內(nèi)所帶的電荷性質(zhì)相反時(shí),由于靜電引力,可使蛋白質(zhì)于反膠團(tuán)中。例如:當(dāng)用陰離子表面活性劑ＡＯＴ構(gòu)成反膠團(tuán)時(shí),其內(nèi)壁帶負(fù)電荷,若水相的ｐＨ值<蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)ｐＩ,則蛋白質(zhì)帶正電荷,在靜電引力的作用下,使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)而實(shí)現(xiàn)了萃取。相反,當(dāng)ｐＨ>ｐＩ時(shí),由于靜電斥力,使溶入反膠團(tuán)的蛋白質(zhì)反向萃取出來(lái),實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃。若使用的是陽(yáng)離子表面活性劑,則情況與上相反。因此,水相的ｐＨ值是影響反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的最主要因素。

影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素

2水相離子強(qiáng)度的影響

水相離子強(qiáng)度的增加產(chǎn)生兩方面的影響:

(1)離子強(qiáng)度影響到反膠團(tuán)內(nèi)壁靜電屏蔽的程度,降低了蛋白質(zhì)分子與反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電作用力；

(2)減小了表面活性劑極性頭之間的相互斥力,使反膠團(tuán)變小。這兩方面的效應(yīng)都會(huì)使蛋白質(zhì)的溶解性下降,甚至使已溶解的蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)中反萃出來(lái)。

影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素3助表面活性劑的影響

蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量往往很大,超過(guò)幾萬(wàn)至幾十萬(wàn),使表面活性劑形成的反膠團(tuán)的大小不足以包容大的蛋白質(zhì),而無(wú)法實(shí)現(xiàn)萃取。此時(shí),加入一些非離子表面活性劑,使它們插入反膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)中,就可以增大反膠團(tuán)的尺寸,溶解較大相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。

影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素4溶劑體系的影響

溶劑的性質(zhì),尤其是極性,對(duì)反膠團(tuán)的形成和大小都有影響,常用的溶劑有:烷烴類(正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等等。有時(shí)也用添加助溶劑,如醇類(正丁醇等)來(lái)調(diào)節(jié)溶劑體系的極性,改變反膠團(tuán)的大小,增加蛋白質(zhì)的溶解度。反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備（1）反膠團(tuán)的臨界膠團(tuán)濃度：將表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑相中能形成反膠團(tuán)的最小濃度稱為臨界膠團(tuán)濃度。（大多數(shù)在0.1～1.0mmol/L的范圍內(nèi)。（2）反膠團(tuán)含水率W：用水和表面活性劑的濃度之比來(lái)定義。W越大，反膠團(tuán)的半徑越大。當(dāng)W＜６～８時(shí)，微水相中的水分子被表面活性劑親水性基團(tuán)強(qiáng)烈的束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且冰點(diǎn)通常低于0攝氏度。反膠團(tuán)的制備方法1：注入法——將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性溶劑中去，然后進(jìn)行攪拌直到形成透明的溶液為止。這種方法的過(guò)程較快并可較好的控制反膠團(tuán)的平均直徑和含水量。方法2：相轉(zhuǎn)移法——將酶或蛋白質(zhì)從主體水相轉(zhuǎn)移到含表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中形成反膠團(tuán)—蛋白質(zhì)溶液。即將含蛋白質(zhì)的水相與含表面活性劑的有機(jī)相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入（萃入）有機(jī)相。此過(guò)程較慢，但最終的體系處于穩(wěn)定的熱力學(xué)平衡狀態(tài)，這種方法可在有機(jī)溶劑相中獲得較高的蛋白質(zhì)濃度。方法3：溶解法——對(duì)非水溶型蛋白質(zhì)可用該法。將含有反膠團(tuán)的有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)固體粉末一起攪拌，使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)中，該法所需時(shí)間較長(zhǎng)。含蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)也是穩(wěn)定的，這也說(shuō)明反膠團(tuán)“水池”中的水與普通水的性質(zhì)是有區(qū)別的。反膠團(tuán)萃取原理從宏觀上看反膠團(tuán)萃取，是有機(jī)相和水相劑間的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微觀上，是從主體水相向溶解于有機(jī)溶劑相中納米級(jí)的、均一且穩(wěn)定的,分散的反膠團(tuán)微水相中的分配萃取。從原理上，可當(dāng)作“液膜”分離操作的一種。萃取進(jìn)入有機(jī)相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，從而避免了與有機(jī)溶劑相直接接觸而引起的變性，失活。蛋白質(zhì)的溶解蛋白質(zhì)向非極性溶劑中反膠團(tuán)的納米級(jí)水池中的溶解，有四種可能：(1)為水殼模型

(2)蛋白質(zhì)中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳?xì)浠衔锵嘟佑|

(3)蛋白質(zhì)被吸附在微膠團(tuán)的“內(nèi)壁”上

(4)蛋白質(zhì)被幾個(gè)微膠團(tuán)所溶解，微膠團(tuán)的非極性尾端與蛋白質(zhì)的親脂部分直接作用反膠團(tuán)萃取決定生理活性物質(zhì)從主體水相萃入反膠團(tuán)微水相內(nèi)的分配系數(shù)，萃取率取決于分離場(chǎng)，分離目標(biāo)物質(zhì)間的相互作用：（1）靜電相互作用（2）立體性相互作用（3）疏水性相互作用（4）特異性相互作用酶，蛋白質(zhì)萃取特性酶，蛋白質(zhì)等生物大分子的空間尺度與反膠團(tuán)的大小相接近。因而所有的相互作用關(guān)系都很重要。（1）靜電相互作用：(a)對(duì)于小分子蛋白質(zhì)(Mr<20000),pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)不能溶入膠團(tuán)內(nèi)，但在等電點(diǎn)附近，急速變?yōu)榭扇?。?dāng)pH<pI時(shí)，即在蛋白質(zhì)帶正電荷的pH范圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團(tuán)內(nèi)。

(b)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量增大到一定程度，即使將pH向酸性一側(cè)偏離pI，萃取率也會(huì)降低。（c）相對(duì)分子量更大的BSA，全pH范圍內(nèi)幾乎都不能萃取（即靜電相互作用效果無(wú)限小，可忽略不計(jì)）（d）降低pH，正電荷量增加，似乎有利于萃取率的提高。這被認(rèn)為是蛋白質(zhì)的pH變性所造成的。（e）添加KCL等無(wú)機(jī)鹽，靜電性相互作用變?nèi)?，萃取率下降。立體性相互作用增大。(2)立體性相互作用：隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，蛋白質(zhì)分子和膠團(tuán)間的立體性相互作用增加，萃取率有下降趨勢(shì)。（3）其他的相互作用：主要是疏水性相互作用和特異性相互作用，目前研究不多。

正向膠團(tuán)(ｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｌｌｅ)是表面活性劑分子在極性溶劑,如水中形成的一種親水基團(tuán)(頭)朝外,而疏水基團(tuán)(尾)朝內(nèi)的具有非極性內(nèi)核的多分子聚集體。洗滌劑中的表面活性劑分子在水中形成的就是這種膠團(tuán),其非極性內(nèi)核可以溶解各種油污。從而達(dá)到去污的效果。與此相反,表面活性劑在非極性溶劑如某些有機(jī)溶劑中就會(huì)形成親水頭向內(nèi)和疏水尾向外的具有極性內(nèi)核(ｐｏｌａｒｃｏｒｅ)的多分子聚集體(ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ),由于其表面活性劑的排列方向與一般的正向膠團(tuán)相反,因此,稱為反膠團(tuán)。

在分離工藝中的應(yīng)用反膠團(tuán)的極性內(nèi)核可以溶解某些極性物質(zhì),而且在此基礎(chǔ)上還可以溶解一些原來(lái)不能溶解的物質(zhì),即所謂二次加溶原理。例如,反膠團(tuán)的極性內(nèi)核在溶解了水后,在內(nèi)核形成了“水池”

(ｗａｔｅｒｐｏｏｌ),可以進(jìn)一步溶解蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等生物活性物質(zhì)。由于膠團(tuán)的屏蔽作用,使這些生物物質(zhì)不與有機(jī)溶劑直接接觸,而水池的微環(huán)境又保護(hù)了生物物質(zhì)的活性,達(dá)到了溶解和分離生物物質(zhì)的目的。

這種技術(shù)既利用了溶劑萃取的優(yōu)點(diǎn),又實(shí)現(xiàn)了生物物質(zhì)的有效分離,成為一種新型的生物分離技術(shù)。

應(yīng)用：三種蛋白質(zhì)的相互分離

利用反膠團(tuán)的方法萃取分離蛋白質(zhì)的研究中,采用ＡＯＴ/異辛烷反膠團(tuán)體系,通過(guò)調(diào)節(jié)水相的ｐＨ和離子強(qiáng)度,分別將α-核糖核酸酶、細(xì)胞色素Ｃ和溶菌酶從三者的混合液中分離開來(lái)。表8-2為這三種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量。

它們的相對(duì)分子質(zhì)量相近,但等電點(diǎn)有一定的差別。在分離工藝中的應(yīng)用當(dāng)ｐＨ>某個(gè)蛋白質(zhì)的ｐＩ時(shí),蛋白質(zhì)帶？帶負(fù)電荷,相反時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷。