方法選擇與檢測系統(tǒng)性能評價課件

第三章方法選擇與檢測系統(tǒng)性能評價教材第29頁

方法學(xué)評價是通過實驗途徑來測定分析方法的性能指標(biāo)，并評價其是否可接受。

方法學(xué)評價的目的在于評估該分析方法在穩(wěn)定狀態(tài)下具有的誤差，并對這些誤差做出判斷，來決定該分析方法是否可以用于常規(guī)測定。

方法學(xué)評價內(nèi)容，通常應(yīng)包括：精密度、準確度、檢測限、生物參考區(qū)間和可報告范圍等。第一節(jié)

實驗方法的選擇

一、實驗方法的分級

IFCC根據(jù)實驗方法的準確度與精密度的不同可以分為三級:

決定性方法、參考方法、常規(guī)方法。特點

①準確度最高，相對誤差最小，測量結(jié)果為“確定值”。②系統(tǒng)誤差最小，經(jīng)詳細研究沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的原因。③常為絕對測量法（結(jié)果是絕對值）。在化學(xué)分析中，重量法和庫侖法屬絕對測量法，同位素稀釋-質(zhì)譜分析法（ID-MS）或中子活化法也可進行絕對測量法。④需精密儀器、高純度試劑、訓(xùn)練有素的技術(shù)人員以及相應(yīng)的環(huán)境。（二）參考方法（referencemethod）是指準確度與精密度已經(jīng)充分證實的分析方法，干擾因素少，系統(tǒng)誤差與重復(fù)測定的隨機誤差相比可以忽略不計，有適當(dāng)?shù)撵`敏度、特異性、線性及較寬的分析范圍。用于評價常規(guī)方法和試劑盒，為二級標(biāo)準品、質(zhì)控物定值。這類方法在條件許可的實驗室（參考實驗室）中使用。（三）常規(guī)方法（routinemethod）

性能指標(biāo)符合臨床或其他常規(guī)目的需要，有足夠的精密度、準確度、特異性和適當(dāng)?shù)姆治龇秶?，簡便?jīng)濟實用。常規(guī)方法經(jīng)充分評價，經(jīng)學(xué)術(shù)組織認可，可以作為推薦方法。如IFCC推薦方法、衛(wèi)生部臨檢中心推薦方法等。二、參考物的分級

參考物，也稱標(biāo)準品或標(biāo)準物質(zhì)，是一類具有一種或多種成分、含量均勻確定的物質(zhì)。參考物用以校準儀器設(shè)備、評價測量方法或給其它物質(zhì)賦值。參考物的結(jié)果含量一般表示為：標(biāo)準值±總不確定度1.一級參考物（原級參考物）

是一種穩(wěn)定而均一的物質(zhì)，它的數(shù)值已由決定性方法確定，或由高度準確的若干方法確定，所含雜質(zhì)也已經(jīng)定量，且有證書。用于校正決定性方法，評價及校正參考方法以及為“二級參考物”定值。一級標(biāo)準品的特點

（1）是已經(jīng)確定的穩(wěn)定而均一的物質(zhì)。（2）所含雜質(zhì)已被定性或定量地標(biāo)明。（3）其數(shù)值由決定性方法確定，或由高度準確的若干方法確定。（4）有公認機構(gòu)頒發(fā)的證書。

2.二級參考物（次級參考物）這類標(biāo)準品可由實驗室自已配制或為商品，它的值必須用一級標(biāo)準品和參考方法并由訓(xùn)練有素的，能熟練掌握參考方法的操作者確定。主要用于常規(guī)方法的校準或為質(zhì)控品定值和常規(guī)測定的結(jié)果計算。3.校準物（校準品）

用于常規(guī)分析儀器校準并具有可溯源性的標(biāo)準物質(zhì)。

常規(guī)測定用校準品：可以不是二級標(biāo)準品。如一些知名公司提供的校準液或稱定標(biāo)液。但必須具有可溯源性。4.控制物（質(zhì)控品）用于常規(guī)質(zhì)量控制，用來控制患者標(biāo)本的測定誤差。質(zhì)控物不能用于儀器的校準。決定性方法用途：評價參考方法及一級參考物一級參考物發(fā)展及評價參考方法，校準決定性方法及參考方法，為二級標(biāo)準品定值參考方法為二級標(biāo)準品及質(zhì)控品定值，評價常規(guī)方法二級參考物、校準品常規(guī)方法的標(biāo)準品，為質(zhì)控品定值常規(guī)方法臨床實驗室的常規(guī)定量分析

質(zhì)控品質(zhì)量保證評價校準校準評價定值評價校準定值各級分析方法與參考物的互相關(guān)系測定結(jié)果測定控制測定1.適用性

（1）微量快速適用于急診和成批分析。（2）方法簡便無需特殊培訓(xùn)，試劑種類少，易于自動化分析。（3）安全可靠試劑無毒害，保存簡便。（4）成本低廉試劑、儀器和輔助設(shè)備成本。（二）可靠性

具有較高的精密度、準確度和特異性，以及較大的檢測范圍。精密度：不精密度一般應(yīng)小于3%。準確度：不準確度一般應(yīng)小于5%。特異性：盡可能只對待測物特異。檢測范圍：能適合正常和大多數(shù)病理標(biāo)本。

四、常規(guī)方法的選擇步驟

臨床提出要求廣泛查閱文獻確定候選方法進行評價實驗…

進行EP9-A2的準備和步驟：1.熟悉檢測系統(tǒng)，熟悉評價方案。2.對整個過程進行質(zhì)量控制。3.至少應(yīng)有40份患者新鮮標(biāo)本，這些標(biāo)本應(yīng)涵蓋線性范圍，不要收集對實驗有干擾的標(biāo)本。4.按標(biāo)本號1、2、3、4、5、6、7、8測定一次，然后8、7、6、5、4、3、2、1測定一次，不同檢測系統(tǒng)同時進行。5.剔除離群值，繪制散點圖，建立線性回歸方程。6.判斷是否可接受。六.定性試驗的方法學(xué)評價（一）評價準備熟悉實驗方法，選擇合適的試劑，使用質(zhì)量控制，使用陰陽性對照…（二）定性試驗重復(fù)性評價

1.確定方法的臨界值（cut-off），是判定陰性陽性的分界點。

2.準備臨界值±20%濃度標(biāo)本。

3.分別測定以上標(biāo)本20次，記錄陰性陽性結(jié)果。

4.測定結(jié)果陰性和陽性結(jié)果應(yīng)該各占一半。

5.結(jié)論：測定結(jié)果陰性和陽性結(jié)果應(yīng)分別大于95%了解（三）定性試驗方法學(xué)比較樣本種類和數(shù)量患者新鮮標(biāo)本，穩(wěn)定。陰性和陽性標(biāo)本應(yīng)分別在50例以上。2.實驗過程在常規(guī)條件下，10-20天完成。3.以符合率進行結(jié)果描述。了解一、量值溯源的概念量值的溯源性

通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或標(biāo)準的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準，通常是與國家標(biāo)準或國際標(biāo)準聯(lián)系起來的特性。二、參考物的量值溯源了解大小比例系統(tǒng)誤差恒定系統(tǒng)誤差比較方法結(jié)果試驗方法結(jié)果系統(tǒng)誤差類型示意圖理想情況四、測量不確定度基本概念表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。（理解：測量不確定度是指由于測量誤差的存在，而對被測量值不能肯定的程度，它表征被測量的真值所處的測量范圍。）測量不確定度計算

A類不確定度估算=測量值標(biāo)準偏差s×因子

B類不確定度估算=儀器誤差總不確定度的合成：“平方和開平方”第三節(jié)檢測系統(tǒng)性能評價評價的意義方法學(xué)評價，是通過實驗途徑測定分析方法的技術(shù)性能，并評價分析性能是否被臨床所接受。評價的基本步驟

1.確定方法的質(zhì)量目標(biāo)，總允許誤差

2.選定評價指標(biāo)，重復(fù)、回收、干擾、比較…3.收集評價的實驗數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)分析

4.判斷方法的臨床可接收性什么是檢測系統(tǒng)？完成一個項目檢測涉及的儀器、試劑、校準品、測定方法、質(zhì)量控制、保養(yǎng)計劃等的（規(guī)定）組合。貝克曼LX20生化儀羅氏的檢測試劑盒貝克曼的校準品葡萄糖氧化酶法如：葡萄糖測定貝克曼LX20生化儀貝克曼的檢測試劑盒貝克曼的校準品葡萄糖氧化酶法兩個不同的檢測系統(tǒng)一、檢測系統(tǒng)的概念及分類完整的檢測系統(tǒng)自建的檢測系統(tǒng)進行性能核實進行詳盡的評估二、檢測系統(tǒng)的評估方法一個檢測系統(tǒng)從廠家的實驗室搬運到我們的常規(guī)實驗室，諸如環(huán)境（供電、供水、溫度、濕度等）和操作人員等的改變，其性能是否還能保持和說明書上的描述一致？……因此需要評估（一）評估內(nèi)容與檢測結(jié)果質(zhì)量相關(guān)的：精密度、準確度、可報告范圍等。（二）評估方法重點是檢測系統(tǒng)性能評價（方法學(xué)評價）

性能評價參考文件美國臨床和實驗室標(biāo)準研究院（CLSI）公布一系列與方法學(xué)評價相關(guān)的文件，如：

EP5-A 精密度評價

EP6-A 線性評價

EP7-A 干擾實驗

EP9-A2 方法比對。。。。。。必要時可以利用上述EP文件對我們的檢測系統(tǒng)進行標(biāo)準化的評估。三、精密度評價–

重復(fù)性試驗

精密度是指同一樣本在規(guī)定條件下多次重復(fù)測得的一系列單次值之間的接近程度，是表示測定結(jié)果中隨機誤差大小的指標(biāo)。精密度一般以變異系數(shù)CV%表示重復(fù)性試驗是評價精密度的常用方法。2.基本方法

對同一材料分成數(shù)份試驗樣品，進行多次分析測定，一般為20次。批內(nèi)重復(fù)性：20次測定，計算x、s、cv%。批間重復(fù)性：一天內(nèi)分數(shù)批重復(fù)20次測定，計算x、s、cv%。一般分5批每批作4次測定。cv%比批內(nèi)大。日間重復(fù)性：每天1次，重復(fù)20天，計算x、s、cv。其cv反映實際工作情況。cv比批間大。－－－3.試驗要點（1）

分析樣品性質(zhì)和分析物濃度分析樣品：校準品、質(zhì)控血清、病人標(biāo)本都可分析物濃度：一般二個濃度參考值或在醫(yī)學(xué)決定水平附近（2）

試驗條件盡量在相同條件下進行性能可接受判斷（1）批內(nèi)或日內(nèi)標(biāo)準差應(yīng)小于等于CLIA88規(guī)定的總允許誤差的1/4（2）日間的標(biāo)準差應(yīng)小于等于CLIA88規(guī)定的總允許誤差的1/3醫(yī)學(xué)決定水平，就是臨床上按照不同病情給予不同處理的指標(biāo)閾值。EP5-A精密度評價方案介紹1.實驗標(biāo)本每天測定2次（2次測定間隔不得少于2小時），每次測定均作雙份，共測定20天，收集80個數(shù)據(jù)（見表3-5）。2.統(tǒng)計處理

每雙份的差值（批內(nèi)差）反映了批內(nèi)精密度每天2次均值的差值反映了天內(nèi)的精密度

20天有20個批間差，減去批內(nèi)差，反映了批間精密度

…（見p46）四、準確度的評價（一）準確度評價指標(biāo)有：方法比較試驗、回收試驗和干擾試驗。（二）方法比較試驗實驗方案：EP9-A21.基本方法：用兩種方法同時對一組新鮮標(biāo)本進行測定，根據(jù)測定結(jié)果的差異，得到恒定或比例系統(tǒng)誤差。

2.實驗要點：（1）比較方法的選擇：盡可能選擇性能高的方法，如參考方法。（2）實驗標(biāo)本與測定（見定量檢測的方法學(xué)比對）標(biāo)本例數(shù)、濃度分布、測定時間、測定順序…比例系統(tǒng)誤差恒定系統(tǒng)誤差比較方法結(jié)果試驗方法結(jié)果3.結(jié)果分析理想情況4.臨床可接受判斷：SE<?TEa為可接受水平。（三）回收試驗

概念在常規(guī)分析樣品中加入純分析物，測定值是否與理論值相同的試驗。目的是測定比例系統(tǒng)誤差，以衡量候選方法的準確度。1.

基本步驟

將被分析的純品標(biāo)準液加入樣品中，成為分析樣品。原樣品加入同量的無分析物的溶液作基礎(chǔ)樣品。然后用實驗方法分析，兩者測定結(jié)果的差值為回收量。32.回收率計算

加入濃度=標(biāo)準液濃度回收濃度=分析樣品測得濃度–基礎(chǔ)樣品測得濃度回收率（%）=一般要求回收率95-105%比例系統(tǒng)誤差

=100%-平均回收率%3回收率接近100％分析不受基質(zhì)影響。無論在純?nèi)芤哼€是復(fù)雜的基質(zhì)環(huán)境中，分析方法的反應(yīng)能力是一樣的。（準確度不受影響）回收率明顯偏離100％分析明顯受不同的基質(zhì)影響。在不同的基質(zhì)環(huán)境下，分析方法的反應(yīng)能力有明顯差異。（準確度受影響）回收率的理解：基質(zhì)：分析樣品中，除了被測物質(zhì)之外的，都稱為~3.

試驗要點（1）加入標(biāo)準液的體積在整個樣品中要少于等于10%。（2）要準確吸量。一般每樣品重復(fù)測定2-3次取均值。（3）分析樣品濃度必須在測定方法的分析范圍內(nèi)。一般需做高中低三個濃度的回收試驗，計算平均回收率。（4）分析樣品濃度最好在醫(yī)學(xué)決定水平上?？山邮芘袛?/p>

一般：SE+RE<TEa（四）干擾試驗

1.概念

在加入一定濃度的干擾物的，形成恒定系統(tǒng)誤差，并將其測定出來。目的也是用來衡量候選方法的準確度。但干擾物濃度不同，誤差大小也不同。干擾作用可有物理作用、化學(xué)作用以及非特異反應(yīng)等。

2.方法基本與回收試驗一樣，但是加入的是疑有干擾或非特異性反應(yīng)的物質(zhì)。4干擾物測定物3.可疑干擾物的濃度應(yīng)達到病理標(biāo)本的最高濃度值，在確證有影響后，還應(yīng)確定使分析結(jié)果影響臨床應(yīng)用價值的最低干擾物質(zhì)濃度值。4.被試驗的物質(zhì)：

可根據(jù)該方法的反應(yīng)原理，提示出可能的干擾物，一般應(yīng)考慮的是用高膽紅素、溶血（血紅蛋白）、脂濁、防腐劑、抗凝劑等進行試驗。但干擾試驗有一定的局限性，因為人們只能試驗?zāi)承┪镔|(zhì)的影響，還有許多藥物和食物成分可能有干擾。五、檢測限評價可檢測的最低分析物濃度為檢測系統(tǒng)的分析靈敏度或稱檢測限。分析靈敏度：具有定性含義的檢測低限

具有定量含義的生物檢測限

功能靈敏度如果空白吸光度的波動服從正態(tài)分布規(guī)律，則95％空白吸光度：空白均值±2s空白待測樣品吸光度只有超過空白均值＋2s空白才被認為樣品中有分析物99.7％空白吸光度：空白均值±3s空白待測樣品吸光度只有超過空白均值＋3s空白才被認為樣品中有分析物(一)檢測低限空白管的波動原因：試劑空白的穩(wěn)定性，比色皿的一致性，比色計的穩(wěn)定性，……如：某5μg/L分析物的吸光度落在檢測低限＝5μg/L（定性）（低于5μg/L時其吸光度與空白吸光度有重疊，無法分辨）對于患者標(biāo)本的檢測，稍大于檢測低限的吸光度說明樣品內(nèi)有分析物，但是，這時還不能正確報告定量結(jié)果。因為是單次測定。對于這個接近檢測低限的樣品做多次重復(fù)測定，按照正態(tài)分布規(guī)律其響應(yīng)值范圍應(yīng)該是X±2s或X±3s，即有50％測定結(jié)果會“無分析物”，有50％的測定結(jié)果“有分析物”。

那么多少檢測吸光度時才能較好地報告定量結(jié)果呢？ˉˉXB-2sBXBXB+2sB(檢測低限）50％50％(二)生物檢測限對于多個接近檢測低限的樣品做多次重復(fù)測定，按照正態(tài)分布規(guī)律其吸光度值范圍應(yīng)該是X±2s（或X±3s），這些較均值小的值就有可能和檢測低限（空白吸光度值的上限）交叉。因此，這些樣品檢測吸光度的95％（或99.7％）單次檢測吸光度的最低值也應(yīng)該比檢測低限大，從而保證樣品在任何情況下，單次檢測吸光度都不是空白吸光度，這些樣品具有的分析物濃度才可以定量的報告?？瞻拙礨B+2sB

生物檢測低限的定義：某樣品單次檢測可能具有的最小吸光度剛大于檢測低限吸光度，該樣品內(nèi)含有的分析物濃度為生物檢測限。（可以定量報告結(jié)果的限值）(三)功能靈敏度以日間重復(fù)測定的CV為20％時，對應(yīng)的檢測限樣品具有的平均濃度作為檢測系統(tǒng)可定量報告的最低濃度。需要多個檢測限濃度的樣品來做精密度試驗，從中選擇CV接近20％的對應(yīng)濃度，作為可定量報告的最低濃度值。分析物濃度越低，精密度實驗CV值越大。六、可報告范圍

可報告范圍指可以報告的所有結(jié)果的范圍。

1.分析測量范圍：沒有進行任何預(yù)處理（稀釋，濃縮等）的樣本，由方法儀器直接測出的結(jié)果范圍。（也稱線性范圍）

2.臨床可報告范圍：對臨床診斷、治療有意義的待測物濃度范圍，可以通過稀釋、濃縮等方法擴大分析測量范圍。

與標(biāo)準曲線制作方法相同。在專用的標(biāo)準曲線紙上畫出標(biāo)準曲線，并進行統(tǒng)計處理得出回歸方程y=a+bx和相關(guān)系數(shù)（r）。線性好差沒有很客觀的判斷指標(biāo)，r接近1為好，0.99以上？？一般認為，如果b在0.97-1.03范圍，a接近0，則可以判斷測定方法可報告范圍在實驗所涉及的范圍。基本步驟（1）樣品準備：評價標(biāo)本的基質(zhì)應(yīng)與實際測定的標(biāo)本相一致，理想的標(biāo)本是病人的低值或高值標(biāo)本。這往往不易收集到，亦可用病人的混合標(biāo)本加入分析物作為高值標(biāo)本，用正常人標(biāo)本作為低值標(biāo)本（必要時可作處理如分析物為酶可以加熱，小分子化合物可以透析，脂類可用超離心或多價陰離子沉淀）。

濃度范圍應(yīng)以分析項目的線性要求為準。線性評價應(yīng)有5個不同濃度，可選擇低值和高值標(biāo)本各一個，低值標(biāo)本為1號，高值標(biāo)本為5號，二者3:1混勻為2號，等份混勻為3號，1:3混勻為4號，2-4號標(biāo)本的濃度按下式計算：C2=1/5C1*3+1/5C5*1

C3=1/5C1*2+1/5C5*2

C4=

1/5C1*1+1/5C5*3（2）測定方法

5個樣品各測定3-4次，結(jié)果進行統(tǒng)計分析，檢驗有無稀