超速離心機(jī)技術(shù)原理與操作維護(hù)注意事項(xiàng)

超速離心計(jì)技術(shù)原理與操作保護(hù)注意事項(xiàng)Abstract：TakingtheOptimaXPN-100ultracentrifugeofBeckmanCoulterCo.，Ltdasanexemplar，thispapermainlydiscussesthecentrifugetechnologyrelatedtotheultracentrifuge，theselectionfactorsoftherotatingheadandthecontainer，andthemattersneedingattentioninroutineuseandmaintenance.Forcentrifugemanagersandlaboratorypersonneltoprovideausefulreferencetoensurethenormaluseoflaboratorycentrifugesandimprovetheefficiencyoftheuseofcentrifuges.Keywords：ultracentrifuge；centrifugetechnology；operation；maintenance前言超速離心計(jì)是經(jīng)過驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)頭高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力場對(duì)樣品中不同樣沉降系數(shù)或浮力密度值的混雜物質(zhì)進(jìn)行快速分別、濃縮和提純的特意設(shè)備，最高轉(zhuǎn)速不低于30，000rpm。超速離心技術(shù)廣泛應(yīng)用于大分子、細(xì)胞、細(xì)胞器等的分別、純化，是生物化學(xué)和分子生物學(xué)不行缺乏的技術(shù)手段。在現(xiàn)代科學(xué)研究中，超速離心分別技術(shù)日益重要。超速離心分別技術(shù)原理超速離心分別技術(shù)在應(yīng)用上可分為制備型超速離心和解析型超速離心兩大類。此中制備型超速離心是濃縮與純化各種顆粒的最常用方法，而依據(jù)相對(duì)離心力與被離心物質(zhì)間的互相作用方式不同樣，超速離心法可分為差速離心法和密度梯度離心法。以貝克曼庫爾特有限公司的OptimaXPN-100的制備型超速離心計(jì)為例，其應(yīng)用范圍主要有病毒及亞細(xì)胞組份分別，蛋白梯度解析，脂蛋白分別，RNA梯度積淀，質(zhì)粒DNA提純，外泌體純化與解析等。以下將重視闡述制備型超速離心技術(shù)的應(yīng)用原理。1.1差速沉降離心差速沉降離心利用離心樣品組分中各顆粒的大小和密度不同樣而存在沉降速度的差別，經(jīng)一準(zhǔn)時(shí)間的相對(duì)離心力作用，各顆粒先后沉降以達(dá)到分別純化的目的，被廣泛應(yīng)用于樣品的粗提純和濃縮。待分其余顆粒間的沉降系數(shù)差值需足夠大（一般為1到幾個(gè)數(shù)目級(jí)），不然分離收效不好。離心過程中，樣品將分別為兩部分，即積淀物和上清液。拿出上清液后，可加大轉(zhuǎn)速對(duì)上清液進(jìn)行再離心，進(jìn)而再次獲取積淀和上清液。這樣多次離心辦理，可達(dá)成樣品中不同樣顆粒的分別。此法要注意掌握好離心時(shí)間和離心力，時(shí)間過長或相對(duì)離心力過多半會(huì)造成雜質(zhì)顆粒沉降下來，影響分別收效，別的，積淀于管底的顆粒簡單受擠壓而變性失活。所獲取的積淀中會(huì)有其余顆粒，不能夠一次獲取純顆粒，需對(duì)積淀進(jìn)行多次再懸浮和再離心，才能獲取較純的顆粒。差速沉降離心法被廣泛應(yīng)用于各種生物樣品，如血清、血漿、細(xì)胞培育液、尿液、唾液和腦脊液等的解析，是目前外泌體分別方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。1.2密度梯度離心密度梯度離心是把樣品顆粒加入到有密度梯度的惰性介質(zhì)液（如氯化銫、蔗糖等）中，利用顆粒與介質(zhì)的密度值不同樣，在必然的相對(duì)離心力作用下，使樣品中不同樣種類顆粒分別集中到梯度介質(zhì)中某些特定地址上，最后獲取不同樣的區(qū)帶，進(jìn)而能夠從不同樣的區(qū)帶中分別采集到純度高的各種顆粒。本法適用于沉降系數(shù)相差不大的顆粒的分別。若是沉降系數(shù)值相差一個(gè)數(shù)目級(jí)以上，一般用差速離心法就可以知足分別需要。密度梯度離心可一次獲取較純的顆粒，適應(yīng)范圍也較廣，既能像差速離心法同樣分別擁有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分別擁有必然密度差的顆粒，顆粒也能保持活性，不會(huì)擠壓變形。同時(shí)，密度梯度離心中惰性梯度介質(zhì)對(duì)流性差，進(jìn)而能夠防備分別后的各區(qū)帶間互相混雜。但此法需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液，離心時(shí)間一般較長，操作也相對(duì)復(fù)雜。1.2.1速率區(qū)帶離心（差速區(qū)帶離心法）用于大小、形狀不同樣而密度周邊的樣品顆粒（即存在必然的沉降系數(shù)差）的分別。先將介質(zhì)液加入離心管，形成一個(gè)連續(xù)的自上而下漸漸增大的密度梯度系列層，再將樣品顆粒加在梯度介質(zhì)液面上，介質(zhì)液常用蔗糖、甘油和Ficoll等，其最大密度一般小于樣品中各組份的密度。在一準(zhǔn)時(shí)間的相對(duì)離心力作用下，顆粒各自以不同樣的速度沉降，最后在梯度介質(zhì)液形成依據(jù)沉降系數(shù)大小由下至上的區(qū)帶。顆粒的沉降系數(shù)越大，向下沉降越快，體現(xiàn)的區(qū)帶也越湊近管底部。此法重點(diǎn)在于精確設(shè)定離心時(shí)間，應(yīng)在各區(qū)帶間距離達(dá)到最大時(shí)立刻停止離心，不能夠高出沉降最快的大顆粒到達(dá)管底的時(shí)間，不然將造成樣品中密度值周邊而沉降系數(shù)相遠(yuǎn)的顆粒集中在同一區(qū)帶內(nèi)，進(jìn)而影響分別純化收效。1.2.2等密度離心本法是使樣品中密度不同樣的各種顆粒分別集中在相應(yīng)密度的梯度介質(zhì)液中，進(jìn)而獲取分別純化。此法離心收效與顆粒的大小、形狀沒關(guān)，僅與密度值有關(guān)，顆粒間密度差值越大，分別收效越好。離心時(shí)間宜長不宜短，平時(shí)大于速率區(qū)帶離心法。離心樣品可加到密度梯度介質(zhì)液的任何地址，在相對(duì)離心力的作用下，因?yàn)槊芏戎档牟煌瑯?，樣品顆粒在介質(zhì)液中將向下或向上分別，當(dāng)顆粒到達(dá)地址的介質(zhì)液的密度與顆粒的浮力密度相等時(shí)，顆粒受力達(dá)到平衡，便在此處形成富集條帶。介質(zhì)液有氯化銫、蔗糖、甘油以及Percoll等，可采納連續(xù)梯度，也可是不連續(xù)梯度。采納連續(xù)梯度時(shí)，密度梯度介質(zhì)液密度范圍應(yīng)包含所要分其余各種顆粒的密度；采納不連續(xù)梯度時(shí)，先將樣品中的較重的顆粒在能夠知足的離心條件下早先分別除去，再把含有所需顆粒的上清部分置于擁有相等密度的不連續(xù)梯度介質(zhì)中離心沉降，密度值低于介質(zhì)的顆粒將上調(diào)而被除去。等密度離心適用于分別整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、核酸、蛋白復(fù)合體以及病毒等。離心轉(zhuǎn)頭和容器的選擇離心計(jì)最常配置的轉(zhuǎn)頭是固定角轉(zhuǎn)頭和水平轉(zhuǎn)頭，比方，OptimaXPN-100超速離心計(jì)固定角轉(zhuǎn)頭包含Type19Ti、Type25Ti、Type45Ti、Type70Ti、Type90Ti、Type100Ti等10個(gè)型號(hào)，對(duì)應(yīng)最高轉(zhuǎn)速從19，000rpm到100，000rpm，水平轉(zhuǎn)頭則有SW28Ti、SW32Ti、SW41Ti、SW60Ti等8個(gè)型號(hào)，對(duì)應(yīng)最高轉(zhuǎn)速從28，000rpm到60，000rpm，其余還有垂直轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭、連續(xù)流/區(qū)帶轉(zhuǎn)優(yōu)等可供選擇。轉(zhuǎn)頭的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)離心技術(shù)的需求。固定角轉(zhuǎn)頭離心管與轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)軸之間有必然的角度（平時(shí)在14°-45°），采納固定角轉(zhuǎn)頭以差速沉降離心分別沉降速度有顯然差別的樣品最有效。水平轉(zhuǎn)頭在轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，處于轉(zhuǎn)頭中的離心管中心線與旋轉(zhuǎn)軸平行，轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)時(shí)，離心管中心線由平行地址漸漸過渡到與旋轉(zhuǎn)軸垂直。使用水平轉(zhuǎn)頭時(shí)，顆粒搬動(dòng)距離長，相應(yīng)的離心時(shí)間也較長。樣品做速率區(qū)帶離心（差速區(qū)帶離心）精選水平轉(zhuǎn)頭，等密度離心則兩種轉(zhuǎn)頭都可選擇。垂直轉(zhuǎn)頭的離心管垂直插入轉(zhuǎn)頭孔內(nèi)，在離心過程中一直與旋轉(zhuǎn)軸平行，此種轉(zhuǎn)頭中樣品顆粒搬動(dòng)距離短，相應(yīng)離心時(shí)間也短，主要用于樣品在短時(shí)間做等密度離心。超速離心計(jì)有各種式樣的離心容器可供選擇，包含一些特其余離心管，如指封管（OptiSeal）、圓錐形密封管（Konical）、高離心力管g-max）和快封管（Quick-Seal）等。離心容器的選擇，除要考慮離心容器的式樣、容量外，還需要考慮離心管材質(zhì)與樣品和溶劑的兼容性。常用離心容器的材質(zhì)有聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚丙烯和聚乙烯聚合物（Polyallomer，PA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）、超凈（Ultra-Clear，UC）、聚乙烯（Polyethylene，PE）、丙酸纖維素CellulosePropionate，CP）、不銹鋼（StainlessSteel，SS）。各種材質(zhì)的離心容器化學(xué)耐受性、物理性質(zhì)及其適用的消毒滅菌方法詳見表1和表2。操作與保護(hù)中應(yīng)注意事項(xiàng)OptimaXPN-100超速離心計(jì)最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100，000rpm，最大相對(duì)離心力為802，400×g，溫度設(shè)定范圍為0-40℃。在操作和保護(hù)過程中，需要注意以下事項(xiàng)：（1）生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域要離心的樣品經(jīng)常要求低溫，為防備因離心過程中設(shè)備溫度降落較慢而使得樣品活性有所破壞，轉(zhuǎn)頭與吊管可提前放冰箱預(yù)冷，使用時(shí)再拿出。（2）樣品必然要配平，可兩兩配平（需要精確到千分之一克），對(duì)稱放置轉(zhuǎn)頭或吊管內(nèi)，放入樣品前檢查轉(zhuǎn)頭或吊管，保證無異物和液體。（3）水平轉(zhuǎn)頭的吊管要對(duì)號(hào)入坐，所有掛上，并檢查可否掛好。（4）安裝轉(zhuǎn)頭前，要保證離心腔體無異物和液體；安裝轉(zhuǎn)頭時(shí)，應(yīng)垂直放在離心軸上，轉(zhuǎn)頭的蓋子要擰緊。（5）儀器運(yùn)行后，操作者要等到所設(shè)轉(zhuǎn)速或相對(duì)離心力達(dá)到設(shè)定值，而且趨于牢固及運(yùn)行正常時(shí)才能夠走開，同時(shí)也要隨時(shí)察看儀器運(yùn)行狀況。（6）使用達(dá)成，拿出轉(zhuǎn)頭并擦試清潔干凈，置于干燥通風(fēng)處；為讓水汽蒸發(fā)，不要立刻關(guān)閉離心計(jì)腔體蓋，待腔體恢復(fù)近似室溫，用干凈干毛巾擦干腔體，再拉上蓋子。（7）不同樣型號(hào)的轉(zhuǎn)頭、離心管和吊管等配件要嚴(yán)格依據(jù)相應(yīng)的操作說明使用，不能夠混用錯(cuò)配。（8）搬動(dòng)轉(zhuǎn)頭時(shí)，注意防備轉(zhuǎn)頭底部的轉(zhuǎn)速鑒別花盤劃花，若是有磨損可能造成轉(zhuǎn)速上不去，此時(shí)應(yīng)實(shí)時(shí)更換。（9）如