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新胚胎干細(xì)胞第一頁,共七十二頁,2022年,8月28日內(nèi)容個體發(fā)生過程干細(xì)胞的概念胚胎干細(xì)胞概念應(yīng)用前景面臨的問題及解決辦法第二頁,共七十二頁,2022年,8月28日一、個體發(fā)生過程受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子
合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層消化道、呼吸道上皮和腺體;肝;膽;胰。內(nèi)細(xì)胞群中胚層結(jié)締組織;血液;肌肉;骨骼;泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結(jié)構(gòu);神經(jīng)系統(tǒng)第三頁,共七十二頁,2022年,8月28日第四頁,共七十二頁,2022年,8月28日囊胚ICM第五頁,共七十二頁,2022年,8月28日第六頁,共七十二頁,2022年,8月28日二、干細(xì)胞的概念1、干細(xì)胞:具有自我復(fù)制的能力,在一定條件下能分化成各種功能細(xì)胞。第七頁,共七十二頁,2022年,8月28日2、分類
(1)全能干細(xì)胞,包括:胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ES細(xì)胞)生殖干細(xì)胞(embryonicgermcells,EG細(xì)胞)
具有全能性,能夠分化成所有細(xì)胞類型,進(jìn)一步形成機體的任何組織和器官。(2)多能干細(xì)胞:具有分化成多種細(xì)胞和組織的潛能,但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力。(3)專能干細(xì)胞:只能向一種或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。第八頁,共七十二頁,2022年,8月28日第九頁,共七十二頁,2022年,8月28日干細(xì)胞是一種能夠分裂成與自身一致的細(xì)胞或幾種特殊分化的細(xì)胞型的細(xì)胞。動物體內(nèi)干細(xì)胞的正常作用是在發(fā)育的過程中可提供不同的細(xì)胞型,以生長成不同的組織和器官。它們也提供替代細(xì)胞以修復(fù)身體不同部分的損傷。第十頁,共七十二頁,2022年,8月28日干細(xì)胞療法就是利用已特殊分化的干細(xì)胞,通過特殊的途徑提供細(xì)胞去替代那些在退行性過程和損傷中失去的細(xì)胞。使用未分化干細(xì)胞也存在畸胎瘤和其他腫瘤形成的風(fēng)險。第十一頁,共七十二頁,2022年,8月28日目前人干細(xì)胞的主要來源或者潛在來源如下:①胚泡,可以提供多能干細(xì)胞;②胎兒組織,可以提供多能或者專能干細(xì)胞;③臍帶血,可以提供專能干細(xì)胞;④成人組織,可提供專能干細(xì)胞或單能干細(xì)胞。第十二頁,共七十二頁,2022年,8月28日三、胚胎干細(xì)胞1、概念胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ESC)是一種從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、克隆等得到的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。ES細(xì)胞可不斷保持增殖而不分化且在連續(xù)培養(yǎng)后仍能具有發(fā)育成三個胚層的潛能。這種細(xì)胞具有與早期胚胎相似的分化潛能和正常二倍體核型,因此兼有早期胚胎卵裂球及體細(xì)胞的某些特性。第十三頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞的全能性(totipotenty),是指ES細(xì)胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力,即ES細(xì)胞發(fā)育成完整動物體的能力。其實質(zhì)是細(xì)胞基因組中決定蛋白質(zhì)編碼的所有基因按一定的時空順序依次表達(dá)。ES細(xì)胞是能在體外大量增殖的全能性細(xì)胞,可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的實驗材料。第十四頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞全能性的檢測方法是以胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植。如果ES細(xì)胞能和去核的細(xì)胞融合發(fā)育成重構(gòu)胚,而且經(jīng)過胚胎移植,重構(gòu)胚能發(fā)育形成個體,則表明ES細(xì)胞具有全能性。例如,將綿羊的類ES細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞中,獲得重構(gòu)胚。重構(gòu)胚經(jīng)過胚胎移植,有活的羔羊產(chǎn)生,證明了綿羊的類ES細(xì)胞具有發(fā)育全能性。第十五頁,共七十二頁,2022年,8月28日2、ES細(xì)胞研究發(fā)展史1981年,英國劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman用囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)建立小鼠ES細(xì)胞系1998年美國Thomson從人的體外受精囊胚中分離得到了ES細(xì)胞。同年約翰霍普金斯大學(xué)的Shamblott等從人的PGC細(xì)胞中分離得到人的全能性干細(xì)胞。人ES細(xì)胞的分離成功給人類的基因治療和器官移植打下了基礎(chǔ)。其他動物只獲得了類ES細(xì)胞。第十六頁,共七十二頁,2022年,8月28日1999年12月,美國《科學(xué)》雜志公布了當(dāng)年世界科學(xué)進(jìn)展的評定結(jié)果,干細(xì)胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前,名列十大科學(xué)進(jìn)展首位。2002年3月,美國麻省理工學(xué)院的科學(xué)家宣布,他們首次利用人體胚胎干細(xì)胞培育出毛細(xì)血管,證明了胚胎干細(xì)胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。目前已有報導(dǎo)ES細(xì)胞能在適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞,胰島細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,肝細(xì)胞等。第十七頁,共七十二頁,2022年,8月28日衍生自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始外胚層的細(xì)胞;永生化(immortal);能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu);有穩(wěn)定的發(fā)育潛能,能被誘導(dǎo)增殖或分化;能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程;
3、胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)第十八頁,共七十二頁,2022年,8月28日4、胚胎干細(xì)胞系的建立過程4.1概述第十九頁,共七十二頁,2022年,8月28日第二十頁,共七十二頁,2022年,8月28日第二十一頁,共七十二頁,2022年,8月28日4.2胚胎干細(xì)胞的分離酶消化后培養(yǎng)免疫方法去處滋養(yǎng)層細(xì)胞流式細(xì)胞儀分離法第二十二頁,共七十二頁,2022年,8月28日4.3培養(yǎng)條件:(1)特殊的培養(yǎng)液:用DMEM培養(yǎng)液,其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要,加非必須氨基酸;β-巰基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層細(xì)胞。(3)必須加入LIF,抑制細(xì)胞分化。第二十三頁,共七十二頁,2022年,8月28日早期胚胎及PGCs的培養(yǎng)將早期胚胎或PGCs置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上,在5%CO2、37-39度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEEM+15%FCS。培養(yǎng)液中可添加多種細(xì)胞因子或分化抑制物,如LIF.EGF.IGF.3-巰基乙醇等。第二十四頁,共七十二頁,2022年,8月28日傳代進(jìn)行體外培養(yǎng)時,當(dāng)ICM增殖后或PGCs出現(xiàn)ES樣克隆后即可傳代。ESC的增殖速度很快,小鼠ESC每7-8h倍增一次;豬類ESC每20h倍增一次;羊類ESC,每40-50h倍增一次;牛類ESC每18-24h倍增一次。傳代時一般是用胰酶EDTA消化,再用微吸管或撥針將其打散成單個細(xì)胞,然后移入新的飼養(yǎng)層上,培養(yǎng)幾天后,即可出現(xiàn)新的克隆點,在其分化之前可以再進(jìn)行傳代。第二十五頁,共七十二頁,2022年,8月28日
5.胚胎干細(xì)胞的鑒別
(1)細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)
ES細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為胞體小、泡狀、核大(核質(zhì)比高)、細(xì)胞聚集成集落生長(鳥巢狀)、細(xì)胞排列緊密、無細(xì)胞界限、能連續(xù)穩(wěn)定傳代且不分化。(2)細(xì)胞功能(3)細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志:AKP陽性(4)細(xì)胞內(nèi)特異基因的表達(dá)第二十六頁,共七十二頁,2022年,8月28日第二十七頁,共七十二頁,2022年,8月28日胚胎干細(xì)胞檢測指標(biāo)(1)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高(3)不被Hoechst33342和Rhodamine123染色(4)細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記:SSEA-3,SSEA-4,
TRA-1-60,TRA-1-81。(5)能分化成三個胚層的細(xì)胞,將胚胎干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤(6)可誘導(dǎo)分化為各種成體干細(xì)胞第二十八頁,共七十二頁,2022年,8月28日ICM細(xì)胞EG細(xì)胞來源附置前早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)早期胎兒生殖嵴原始生殖細(xì)胞形態(tài)學(xué)直徑一般為12~15μm直徑一般15~18μm胰島素樣生長因子受體(Insulin-likereceptor,Igf2r)基因甲基化狀態(tài)印記基因Igf2r包含1個母系甲基化位點和1個父系非甲基化位點印記基因Igf2r兩個位點均處于非甲基化狀態(tài)體內(nèi)分化形成畸胎瘤不形成6.兩種來源的ES細(xì)胞的區(qū)別第二十九頁,共七十二頁,2022年,8月28日7.ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化第三十頁,共七十二頁,2022年,8月28日第三十一頁,共七十二頁,2022年,8月28日干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的常用方法(1)加入誘導(dǎo)細(xì)胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì),如VGEF、bFGF、DMSO和RA等(2)將ES細(xì)胞與特定的細(xì)胞共培養(yǎng)(3)將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞內(nèi)第三十二頁,共七十二頁,2022年,8月28日四、ES細(xì)胞的應(yīng)用前景胚胎干細(xì)胞(ES)成為當(dāng)今生命科學(xué)和生物技術(shù)研究的熱點。這與它具有“發(fā)育全能性”的神奇功能密切相關(guān)。干細(xì)胞是未分化的原始細(xì)胞。其中,全能干細(xì)胞能分化成人體200多種細(xì)胞類型,形成機體的任何細(xì)胞、組織和器官。第三十三頁,共七十二頁,2022年,8月28日倘能掌握其分化發(fā)育的規(guī)律,在人工條件下定向分化為所需的細(xì)胞、組織乃至器官,就可以用來治療目前還難以或無法治愈的帕金森氏病、早老性癡呆、白血病、糖尿病等頑癥,并且解決十分緊缺的組織和器官移植的來源問題嗎?進(jìn)一步,與克隆技術(shù)相結(jié)合,運用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)來得到ES,還能解決細(xì)胞治療以及組織和器官移植的免疫排異難題。
第三十四頁,共七十二頁,2022年,8月28日1.胚胎干細(xì)胞研究的意義ES細(xì)胞特有的生物學(xué)特性,決定了其在生物學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的應(yīng)用價值。在進(jìn)行ES細(xì)胞建系和定向分化的同時,以ES細(xì)胞為材料,在核移植、嵌合體、轉(zhuǎn)基因動物研究等方面也進(jìn)行了廣泛的嘗試,已經(jīng)充分體現(xiàn)出ES細(xì)胞在加快良種家畜繁育、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物、哺乳動物發(fā)育模型、基因和細(xì)胞治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。第三十五頁,共七十二頁,2022年,8月28日
近幾年來,胚胎工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、組織工程技術(shù)與ES細(xì)胞研究的結(jié)合已經(jīng)成為現(xiàn)實,將使相關(guān)的基礎(chǔ)學(xué)科研究以及醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)等發(fā)生重大變化,走向一個新的時代。第三十六頁,共七十二頁,2022年,8月28日2.胚胎干細(xì)胞的用途為在細(xì)胞和分子水平研究研究哺乳動物早期胚胎發(fā)育規(guī)律提供了良好的材料和方法,是基因功能研究的有效手段。細(xì)胞分化機制,細(xì)胞癌變機理用于新藥的發(fā)現(xiàn)、篩選及安全性實驗:如藥物機理及毒性實驗重要的臨床價值,可作為組織移植、細(xì)胞治療和基因治療的細(xì)胞來源:制造細(xì)胞、組織和器官;人ES定向誘導(dǎo)分化為人體器官;生產(chǎn)用于人類器官移植的動物器官:無免疫排斥;豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。第三十七頁,共七十二頁,2022年,8月28日生產(chǎn)克隆動物:由于ES細(xì)胞是具有全能性、未分化的細(xì)胞,因此是制作克隆動物很好的核供體。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物:建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,抗病育種;藥用蛋白第三十八頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞可作為基因打靶的靶細(xì)胞,經(jīng)打靶引入定點整合外源基因,提高轉(zhuǎn)基因動物的整合率和表達(dá)效果。ES細(xì)胞也可進(jìn)行基因敲除,獲得基因敲除動物,如豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。第三十九頁,共七十二頁,2022年,8月28日在發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究中,利用ES細(xì)胞研究細(xì)胞分化的機埋,有助于闡明細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的機制。ES細(xì)胞的多能性可以在一定培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化為特定的細(xì)胞。試驗證明,體外誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞的分化,可形成內(nèi)臟卵黃囊、心肌層,也可以得到神經(jīng)元樣細(xì)胞和成纖維樣的細(xì)胞。第四十頁,共七十二頁,2022年,8月28日使人的ES細(xì)胞與豬等動物的胚胎結(jié)合,可得到人-豬嵌合體動物,由于ES細(xì)胞具有全能性,可分化形成不同胚層,包括某些器官,這樣的器官與人的器官具有相同的免疫特性,因此它不會對人產(chǎn)生排異反應(yīng)。第四十一頁,共七十二頁,2022年,8月28日人的ES細(xì)胞也可在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng),生產(chǎn)人的肌肉、神經(jīng)和造血細(xì)胞的細(xì)胞組織,在治療人的某些疾病上有重要的應(yīng)用價值??茖W(xué)家們一直試圖誘導(dǎo)各種干細(xì)胞定向分化為特定的組織來替代那些受損的體內(nèi)組織,比如把產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)。第四十二頁,共七十二頁,2022年,8月28日科學(xué)家們已經(jīng)能夠使豬ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘鴦拥男募〖?xì)胞,使人ES細(xì)胞生成神經(jīng)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞,并能使小鼠ES細(xì)胞分化為內(nèi)胚層細(xì)胞。這些結(jié)果為細(xì)胞和組織替代療法開辟了道路。目前,科學(xué)家已成功分離到人ES細(xì)胞,而體細(xì)胞克隆技術(shù)為生產(chǎn)患者自身的ES細(xì)胞提供了可能。第四十三頁,共七十二頁,2022年,8月28日治療性克?。后w細(xì)胞核移植(SCNT)去核卵細(xì)胞+體細(xì)胞核克隆囊胚分離內(nèi)細(xì)胞群
ES細(xì)胞第四十四頁,共七十二頁,2022年,8月28日把患者體細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中形成重組胚,把重組胚體外培養(yǎng)到囊胚,然后從囊胚內(nèi)分離出ES細(xì)胞,獲得的ES細(xì)胞使之定向分化為所需的特定細(xì)胞類型(如神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和血細(xì)胞),用于替代療法。這種核移植法的最終目的是用于干細(xì)胞治療,而非得到克隆個體,科學(xué)家們稱之為“治療克隆”。生殖性克隆第四十五頁,共七十二頁,2022年,8月28日2.第四十六頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞研究的倫理問題ES研究也引發(fā)了當(dāng)前最為激烈而敏感的倫理之爭。主要圍繞兩個問題而展開:一是如何看待胚胎。ES主要有三個來源:(1)(自然和人工)流產(chǎn)的胚胎;(2)輔助生殖剩余的胚胎;(3)通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移術(shù)得到的胚胎。第四十七頁,共七十二頁,2022年,8月28日不管哪一個來源,提取ES必定會損毀胚胎。于是,胚胎是不是生命,是不是人,研究ES是不是“毀滅生命”、“殺人”,很自然地成為爭論的焦點。國內(nèi)認(rèn)為:與“胚胎”的生命相比,“人”的生命具有優(yōu)先權(quán),可以殺死胚胎來救“人”的生命。第四十八頁,共七十二頁,2022年,8月28日另一焦點在于,是否必然滑向生殖性克隆。2003年10月,聯(lián)合國大會以80票贊成、79票反對、15票棄權(quán)的表決結(jié)果,將《禁止人的克隆生殖國際公約》推遲一年。世界各國都表示反對生殖性克隆,為什么這一國際公約通不過呢?因為79個國家認(rèn)為治療性克隆必然滑向生殖性克隆,主張二者同時禁止。治療性克隆是ES研究的主要目的。封殺治療性克隆,實際上就是要封殺ES研究。第四十九頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展方向ES細(xì)胞維持自我更新和定向分化的分子機理ES細(xì)胞治療技術(shù)的研究ES細(xì)胞作工具探討基因功能和個體的發(fā)生發(fā)育ES細(xì)胞治療中的免疫排斥問題治療型克隆技術(shù)分離ES細(xì)胞新途徑的研究用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜第五十頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞具有可以無限地傳代增殖,而且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點。
如果以ES細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,可以在短時間內(nèi)獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個體。
而且用ES細(xì)胞與胚胎進(jìn)行嵌合克隆動物,可以解決哺乳動物遠(yuǎn)緣雜交的困難,生產(chǎn)出珍貴的動物,也可以進(jìn)行異種動物克隆,有助于保護(hù)珍惜野生動物。ES細(xì)胞與動物克隆第五十一頁,共七十二頁,2022年,8月28日盡管體細(xì)胞克隆與ES細(xì)胞克隆相比有著易于取材的特點,但是體細(xì)胞克隆也存在著不少缺點,如生理和免疫缺陷,目前體細(xì)胞克隆還不能完全代替ES細(xì)胞克隆。第五十二頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞作基因載體
目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法是向受精卵中注射DNA,外源基因的整合、表達(dá)和篩選工作是在個體水平上進(jìn)行的,不僅工作繁瑣,周期長成功率低,產(chǎn)生的后代的遺傳性狀也常出現(xiàn)分離;
第五十三頁,共七十二頁,2022年,8月28日而利用ES細(xì)胞作為基因載體,得到基因整合的細(xì)胞,將載體ES細(xì)胞直接進(jìn)行核移植或者通過與胚胎嵌合獲得嵌合動物,ES細(xì)胞在嵌合體中分化發(fā)育成全能性的生殖細(xì)胞,即可以得到攜有目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。第五十四頁,共七十二頁,2022年,8月28日因為一個優(yōu)良的ES細(xì)胞系不僅可以用于各種目的基因轉(zhuǎn)化,用各種方法將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞,而且外源基因的整合數(shù)目、位點、表達(dá)程序以及穩(wěn)定性等都可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行加工,篩選,在很大程度上加快了動物遺傳工程的進(jìn)程。第五十五頁,共七十二頁,2022年,8月28日第五十六頁,共七十二頁,2022年,8月28日改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件,建立更有效更簡便的獲得ES細(xì)胞的方法。定向誘導(dǎo)分化成特定類型細(xì)胞,用于臨床疾病的治療,并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題。成體干細(xì)胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細(xì)胞的比較,成體干細(xì)胞能否替代胚胎干細(xì)胞?第五十七頁,共七十二頁,2022年,8月28日嵌合體實驗和克隆動物實驗是將ES細(xì)胞與正常的胚胎融合制作嵌合體或?qū)S細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,產(chǎn)生克隆動物后代。這兩者是檢驗ES細(xì)胞的最有效、最有說服力的方法。第五十八頁,共七十二頁,2022年,8月28日人的ES細(xì)胞可以高水平地表達(dá)端粒酶活性,二倍體的人體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶,并且隨著年齡的增長端粒變短,而在組織培養(yǎng)達(dá)到一定增殖壽命時,就開始衰老。與此相反,端粒酶在生殖系和胚胎組織中都有很高的活性。ES細(xì)胞中的高水平端粒酶活性證實了它的壽命將超過體細(xì)胞。第五十九頁,共七十二頁,2022年,8月28日ES細(xì)胞系的分離效率低ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的理論和技術(shù)水平低:隨機的,運氣。第六十頁,共七十二頁,2022年,8月28日解決胚胎來源有限的途徑:未成熟卵的體外成熟第六十一頁,共七十二頁,2022年,8月
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