普通儀和熒光定量?jī)x的使用

普通儀和熒光定量?jī)x的使用第一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartI中心PCR(polymerasechainreaction)儀簡(jiǎn)介PartIIPCR原理PartIII普通PCR儀操作規(guī)程PartⅣ熒光定量PCR原理PartⅤ熒光定量PCR儀操作規(guī)程第二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartI中心PCR儀簡(jiǎn)介熒光定量PCR儀Rotorgene3000普通PCR儀GeneAMPSystem9700第三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartIIPCR原理AAAA蛋白/酶DNAmRNA蛋白中心法則基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平翻譯水平基因水平（Realtime）RT-PCRWesternblotPCR核酸的功能是儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)移遺傳信息，指導(dǎo)和控制蛋白質(zhì)的合成；而蛋白質(zhì)的主要功能是進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)和作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成成分。

第四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR概念利用DNA聚合酶、一對(duì)引物和四種dNTP（三磷酸脫氧核苷酸），對(duì)模板DNA反復(fù)多次地進(jìn)行復(fù)制，從而得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)過(guò)程，稱為PCR。PartIIPCR原理第五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartIIPCR原理PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）模板（template）第六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartIIPCR原理PCR擴(kuò)增的基本反應(yīng)步驟1、變性：加熱至95oC左右，使模板DNA變性。2、退火：降低溫度至適合的溫度（55oC左右，引物與模板DNA的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。3、延伸：溫度在70oC左右時(shí)，TaqDNA聚合酶從引物3'端催化復(fù)制鏈以5'

-3'方向延伸。第七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PartIIPCR原理第八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartIIPCR原理PCR原理PCR的理論方程：Y=x×(1+Ev)n

Y：擴(kuò)增物數(shù)量；X：起始模板數(shù)量；Ev：擴(kuò)增效率；n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)第九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartIII普通PCR儀操作規(guī)程開機(jī)操作：打開PCR儀電源開關(guān)；向后平推PCR儀頂蓋，放入PCR薄壁管。向前平推PCR儀頂蓋，并均勻用力將反扣部分壓下。注意：9700PCR儀必須使用圓頭的PCR薄壁管。第十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程GeneAmpPCRSystem9700Version3.05User:***RunCreatEditUtilUserF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程SelectUserName<<pre>>cqllyf

……AcceptNewEditDeleteCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程UserName___UseENTERkeytoselectacharacter.AcceptBackspCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopabcdefghijklmnopqrstuvwxyz第十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程MethodsizelastusedExp000qin0903/01/06Exp001qin1904/10/06StartViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程StartReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08第十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程MethodsizelastusedExp000qin0903/01/06Exp001qin1904/10/06EditViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程EditReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08第十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日關(guān)機(jī)操作：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后點(diǎn)擊Exit至出現(xiàn)主界面，關(guān)閉PCR儀電源開關(guān)；均勻用力將反扣部分抬起，向后平推PCR儀頂蓋，取出PCR薄壁管。向前平推PCR儀頂蓋。PartIII普通PCR儀操作規(guī)程第十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日

首先，傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法在測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物前需打開反應(yīng)管，容易造成產(chǎn)物污染，成為“假陽(yáng)性”的主要來(lái)源。實(shí)時(shí)PCR在擴(kuò)增過(guò)程中動(dòng)態(tài)檢測(cè)，完全以閉管方式進(jìn)行，不僅操作簡(jiǎn)便，也杜絕了產(chǎn)物污染源。其次，傳統(tǒng)PCR都是在PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)。PCR經(jīng)過(guò)指數(shù)期后，對(duì)反應(yīng)條件的變化十分敏感，擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期的信號(hào)強(qiáng)度重現(xiàn)性很差。實(shí)時(shí)PCR方法則在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此具有重復(fù)性。PartIV熒光定量PCR原理第十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報(bào)告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度PCR循環(huán)=雙鏈DNA=染料=熒光后來(lái)用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBRGreenI取代EBPartIV熒光定量PCR原理第二十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日激發(fā)光Ct值PartIV熒光定量PCR原理使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。第二十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日PartIV

熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和熒光檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合

通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控PCR反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)儀器和相應(yīng)的軟件分析結(jié)果，對(duì)待測(cè)樣品的初始模板進(jìn)行定量或定性分析。第二十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料

SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman MolecularBeacons

FRET引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)PartIV熒光定量PCR原理第二十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日SYBR-GreenI

dsDNA的內(nèi)插染料是一種能插入到雙鏈DNA并發(fā)出強(qiáng)烈熒光的化學(xué)物質(zhì)，其熒光強(qiáng)度的增加與dsDNA的數(shù)量成正比。如SYBRGreenⅠ染料，當(dāng)它沒(méi)有結(jié)合上雙鏈DNA時(shí)，只發(fā)出相對(duì)弱的熒光；然而，當(dāng)它一旦插入到雙鏈DNA里時(shí)，熒光信號(hào)將會(huì)強(qiáng)烈地增加，從而根據(jù)熒光信號(hào)的增強(qiáng)來(lái)計(jì)算PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。PartIV熒光定量PCR原理第二十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PartIV熒光定量PCR原理第二十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

PartIV熒光定量PCR原理第二十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）

5’端標(biāo)記熒光分子（如：FAM），在3’端標(biāo)記一個(gè)吸收或淬滅熒光的分子（如：TAMRA），這樣5’端激發(fā)出的熒光會(huì)被3’端的分子淬滅或吸收掉，所以開始時(shí)，儀器并不能檢測(cè)到熒光。由于Taq聚合酶同時(shí)具有5’端外切酶的活性，在PCR反應(yīng)的延伸階段，Taq酶會(huì)把5’端的熒光分子切下，使其與3’端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。每一個(gè)循環(huán)，隨著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)，從而根據(jù)熒光信號(hào)的增強(qiáng)來(lái)計(jì)算PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的增加。PartIV熒光定量PCR原理第二十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitationPartIV熒光定量PCR原理第二十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同=>對(duì)引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物第二十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer長(zhǎng)度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性

△

引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列

△

引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序列

△

整體上堿基不能過(guò)偏

△

個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)

△

避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★

△

3’末端避免GCrich或ATrich

△

3’末端堿基最好為G或C

△

3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計(jì)原則第三十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測(cè)靈敏度確認(rèn)35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。NoTemplateControl確認(rèn)30Cycles內(nèi)無(wú)引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應(yīng)性能確認(rèn)第三十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日1、開始運(yùn)行儀器 打開PCR儀底座開關(guān)，再打開定量PCR儀檢測(cè)器開關(guān)。實(shí)驗(yàn)前先讓系統(tǒng)預(yù)熱30分鐘，打開電腦，啟動(dòng)iQ5軟件。2、放置樣品 將PCR反應(yīng)體系加入到0.2ml的薄壁管或96孔板中，蓋上管蓋。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手