單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移用于生物大分子構(gòu)象動態(tài)變化過程研究進展

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摘要生物大分子參與生命活動的各個過程，在單分子水平上實時觀測和分析生物大分子自身的布局動態(tài)以及生物大分子相互作用的動態(tài)過程，對于深入理解生物大分子的作用機制具有重要意義。自提出以來，單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)逐步呈現(xiàn)出其在研究生物大分子構(gòu)象變化和相互作用過程等方面的巨大潛力，一系列新的作用機理不斷被提出。本文對單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在蛋白質(zhì)與核酸分子構(gòu)象動態(tài)變化、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)-核酸相互作用等方面取得的研究進展舉行了綜述。

關(guān)鍵詞單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移；生物大分子；構(gòu)象動態(tài)；相互作用；評述

1引言

細胞生命活動各個過程都離不開蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子。研究生物大分子的作用機制對于理解根本生物學過程至關(guān)重要，然而普遍的生物學研究手段無法實時觀測生物大分子發(fā)揮作用時的狀態(tài)變化，只能間接地觀測宏觀現(xiàn)象，然后對過程機制舉行推斷。依據(jù)宏觀現(xiàn)象推出的作用機理只能在確定程度上扶助人們熟悉生物過程，生物分子到底如何發(fā)揮作用，務必有微觀的證據(jù)才更有壓服力，例如ATP合成酶的作用機制、G蛋白偶聯(lián)受體如何傳遞信號等，都是在取得單分子水平上的證據(jù)后才得到更加深入的熟悉[1～3]。對于宏觀系綜研究，單分子研究的最大優(yōu)勢是可以直接觀測到單個生物分子發(fā)揮作用時的構(gòu)象動態(tài)或生物分子間相互作用時分子間距離的變化[4～8]，獲取的機制更加接近真實處境。此外，單分子水平的研究能夠透露生物分子之間的個體差異[9]，有助于全面深入地熟悉生物分子的功能性質(zhì)。

目前，在單分子水平研究生物分子構(gòu)象變化或生物分子相互作用動態(tài)過程的技術(shù)有光鑷[10]、磁鑷[11，12]、原子力顯微鏡[13～16]及單分子熒光技術(shù)[17～21]。光鑷和磁鑷技術(shù)要求高，操作難度大，無法舉行高通量研究；原子力顯微鏡的成像時間辨識率低，因此在單分子研究方面應用不多。單分子熒光技術(shù)起源于20世紀90年頭[17]，目前已經(jīng)逐步成熟地被用于生物學領(lǐng)域，并展現(xiàn)多個分支，其中單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（SM-FRET）被廣泛用于生物分子相互作用的研究[22]。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)是指能夠觀測單個生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉(zhuǎn)移的技術(shù)[23]，具有以下優(yōu)勢：（1）熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理使其能夠觀測到生物大分子發(fā)揮功能時不同布局域或亞基之間空間位置的變化，或者分子之間相對距離的變化[23]，這些變化對于直接理解生物分子的作用機制特別重要；（2）目前全內(nèi)反射熒光顯微鏡廣泛應用于SM-FRET研究，其利用激光全反射產(chǎn)生的隱逝波舉行照明，具有極高的信噪比，能夠觀測到界面上單個熒光分子；同時利用高速的制冷型電荷耦合器件（CCD）舉行成像，時間辨識率可以達成亞毫秒水平。該高時間辨識率對于實時觀測快速的相互作用或構(gòu)象變化過程至關(guān)重要[24]；（3）光學成像允許同時對多個目標舉行觀測，高通量觀測便于比對被研究對象個體之間的差異；（4）成熟的基因工程技術(shù)和化學修飾方法使得研究者能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)或核酸分子舉行定點熒光標記[25～28]，同時，豐富的界面封閉和目標物固定方法可以保證觀測的特異性[23]。自1996年，基于SM-FRET技術(shù)的研究取得了一系列成果[29]。本文將圍繞單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在蛋白分子自身構(gòu)象動態(tài)變化[30～38]、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用[6，7，39]、核酸分子自身構(gòu)象動態(tài)變化[40～47]以及蛋白質(zhì)-核酸動態(tài)相互作用[48～62]等方面取得的一些代表性研究成果舉行綜述。

2單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象是供體熒光分子的放射光譜與受體熒光分子的激發(fā)光譜相重疊，且兩個分子間距離小于10nm時，供體的激發(fā)能誘發(fā)受體發(fā)出熒光，同時供體自身的熒光強度減弱的現(xiàn)象，在生物學研究中常被用于鑒定兩種蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生相互作用。SM-FRET技術(shù)是觀測單個生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉(zhuǎn)移。目前，SM-FRET測驗中最常用的成像儀器是全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM），包括棱鏡型和物鏡型兩類（圖1A）[63]。商業(yè)化的TIRFM多為物鏡型，這是由于物鏡型TIRFM激發(fā)光和熒光都經(jīng)過物鏡，樣品臺有更大的操作空間，能夠更好的與其它設(shè)備聯(lián)用，如顯微操作設(shè)備。除了設(shè)備，SM-FRET測驗最關(guān)鍵的是研究對象的定點熒光標記以及對象在界面上的特異性固定。核酸定點標記對比輕易，蛋白定點標記那么要憑借基因工程手段，還要保證標記的位點不影響蛋白布局。將研究對象特異性地固定在石英片或蓋玻片外觀，對于觀測測驗特別重要，目前常用的方式是用聚乙二醇（PEG）封閉玻璃外觀，然后通過抗體或生物素-親和素舉行固定（圖1B）[63]。SM-FRET測驗中獲得的數(shù)據(jù)是熒光供體和受體分子熒光強度隨時間的變化的軌跡，然后通過表觀FRET效率方程計算出對應的FRET效率隨時間變化的軌跡（圖1C）[63]，進而對FRET效率舉行統(tǒng)計分析，以獲得變化規(guī)律。

3單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用于生物大分子構(gòu)象和相互作用動態(tài)研究

3.1單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究蛋白分子構(gòu)象動態(tài)

蛋白質(zhì)分子的折疊和構(gòu)象動態(tài)變化直接關(guān)系到其自身功能，研究蛋白質(zhì)折疊過程和構(gòu)象動態(tài)變化，有助于理解蛋白分子形告成能布局及發(fā)揮功能的機理。1999年，Ha等[30]首次將SM-FRET應用于單個葡萄球菌核酸酶（Staphylococcalnuclease，SNase）分子的布局動態(tài)研究。他們將熒光供體（Tetramethylrhodamine，TMR）和熒光受體（Cy5）修飾到SNase的兩個特定位點上，通過觀測分析單個SNase上TMR和Cy5的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，察覺SNase分子之間存在