氨基酸的發(fā)酵

氨基酸的發(fā)酵第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日第11章氨基酸發(fā)酵11.1概述一、氨基酸的種類氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，通常由5種元素組成，即C、H、O、N、S。在自然界中，已發(fā)現(xiàn)組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種，而這20多種氨基酸都是羧酸分子中α-C上的一個氫被氨基所取代而成的化合物，故稱α-氨基酸。第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、氨基酸的應(yīng)用1、在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用2、在食品工業(yè)中的應(yīng)用3、在飼料工業(yè)中的應(yīng)用4、在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用5、在化學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、氨基酸的生產(chǎn)方法1、蛋白質(zhì)水解提取法將蛋白質(zhì)經(jīng)酸堿水解后，再經(jīng)分離純化獲得各種氨基酸。2、直接發(fā)酵法

所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。

20種基本氨基酸中有18種能用這種方法生產(chǎn)，其中產(chǎn)量最大的是谷氨酸。第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日3、酶法利用微生物細胞或微生物產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。4、化學(xué)合成法利用有機合成和化學(xué)工程的技術(shù)生產(chǎn)和制備氨基酸5、添加前體發(fā)酵法又稱微生物轉(zhuǎn)化法。第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日

傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高，工藝復(fù)雜，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。所以現(xiàn)在生產(chǎn)氨基酸的方法多為微生物發(fā)酵法。四、氨基酸工業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀和動態(tài)我國氨基酸工業(yè)是從20世紀(jì)60年代開始起步的，先后開展了蛋白質(zhì)水解提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)氨基酸的研究。

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目前生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。國內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司，但目前無論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國外抗衡。第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日

在80年代中后期，我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品，1991年銷售量為二千萬瓶，1996年達六千萬瓶，主要廠家有無錫華瑞、北京費森尤斯、昆明康普萊特，但生產(chǎn)原料都依賴進口。到2000年，世界氨基酸產(chǎn)值達45億美元，占生物技術(shù)市場的7%，國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達40億元，占全國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日11.2谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)

現(xiàn)在發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)氨基酸已有20多種，已經(jīng)成為氨基酸生產(chǎn)的主要方法。在各種氨基酸的生產(chǎn)中，以谷氨酸的發(fā)酵規(guī)模、產(chǎn)量最大。第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日11.2.1谷氨酸生產(chǎn)原料

一、谷氨酸生產(chǎn)原料谷氨酸生產(chǎn)原料有碳源、氮源、無機鹽和生長因子等。

1.碳源工業(yè)上谷氨酸發(fā)酵采用的碳源一般都是淀粉原料，如玉米、小麥、甘薯、大米等，其中甘薯和淀粉最為常用。第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日

淀粉原料要先通過制糖工藝水解成微生物可直接利用的葡萄糖，然后再投放到發(fā)酵罐。此外也可用糖蜜原料作為碳源，如甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。糖蜜因富含生物素，在發(fā)酵前需要經(jīng)活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日

2.氮源氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸及谷氨酸的原料。氮源比碳源對谷氨酸發(fā)酵影響更大，約85％的氮源被用于合成谷氨酸，另外15％用于合成菌體。一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100:（0.2～2.0），谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:（15～21）。目前生產(chǎn)上多采用尿素或氨水作為氮源，進行分批流加。第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.無機鹽無機鹽是微生物維持生命活動不可缺少的物質(zhì)。其中磷酸鹽在谷氨酸發(fā)酵非常重要，它是谷氨酸發(fā)酵過程中必須的，但濃度不能過高，否則會轉(zhuǎn)向纈氨酸發(fā)酵。

4.生長因子糖質(zhì)為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌幾乎都是生物素缺陷型，以生物素為生長因子。在發(fā)酵過程中“亞適量”生物素有利于積累谷氨酸。實際生產(chǎn)中通過添加玉米漿、麩皮水解液、糖蜜等作為生長因子的來源，來滿足谷氨酸生產(chǎn)菌必須的生長因子。第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、淀粉水解糖的制備淀粉是由葡萄糖組成的生物大分子，大多數(shù)的微生物都不能直接利用，生產(chǎn)中都要求將淀粉進行糖化，制備成淀粉水解糖使用。在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外尚有數(shù)量不等的麥芽糖以其他一些二糖、低聚糖等糖類少量。淀粉水解糖的制備方法有下列4種：第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日1、酸解法（酸糖化法）

它是以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。淀粉酸（催化劑）高溫高壓葡萄糖第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日優(yōu)點：（1）生產(chǎn)簡易，對設(shè)備要求簡單。（2）水解時間短。（3）設(shè)備生產(chǎn)能力比較大。缺點：（1）要求有耐腐蝕、耐高溫高壓的設(shè)備。（2）副反應(yīng)的發(fā)生，造成葡萄糖的損失而使淀粉的轉(zhuǎn)化率降低。（3）淀粉顆粒大小不均造成水解不徹底。（4）淀粉乳濃度也不宜過高。第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日2、酶解法（雙酶水解法）

是用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖。此法分為兩步：淀粉液糊精及低聚糖a-淀粉酶水解糖化酶水解液化（增加淀粉的可溶性）糖化葡萄糖第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日優(yōu)點：（1）酶水解反應(yīng)條件較溫和，不需要耐腐蝕、耐高溫、高壓的設(shè)備。（2）酶專一性強，水解副反應(yīng)少，水解糖液純度高，淀粉的轉(zhuǎn)化率高。（3）可在較高的淀粉乳液濃度下水解。（4）糖液顏色淺、較純凈、無苦味、質(zhì)量高，有利于精制。第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日缺點：（1）酶水解反應(yīng)時間較長，一般從投料到糖化完畢需2～3天時間。（2）要求設(shè)備較多。（3）需要具備有專門培養(yǎng)酶的條件。（4）糖液過濾困難。第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日3、酸酶結(jié)合法

酸酶結(jié)合水解法是集酸法和酶法制糖的優(yōu)點而采用的結(jié)合生產(chǎn)工藝。根據(jù)淀粉原料性質(zhì)又可分為酸酶水解法和酶酸水解法。第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日（1）酸酶水解法淀粉糊精或低聚糖

酸糖化酶葡萄糖優(yōu)點：（1）酸液化速度快，且用量少。（2）對液化液的要求不高。（3）可采用較高的淀粉乳濃度，以提高生產(chǎn)效率。第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日（2）酶酸水解法淀粉乳淀粉液α-淀粉酶過濾、除雜

酸水解葡萄糖優(yōu)點：（1）能采用粗原料淀粉。（2）淀粉濃度較酸法高，生產(chǎn)較易控制。（3）水解時間短，糖液色澤淺。（4）酸水解pH值稍高，可減少淀粉水解副反應(yīng)的發(fā)生。第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日

采用不同的水解制糖工藝，各有其優(yōu)點和不足。從水解糖液的質(zhì)量及降低糖耗，提高原料利用率方面考慮，雙酶法最好，其次是酸酶法，最差的是酶酸法、酸法。從淀粉水解整個過程所需的時間來說，則酸法時間最短，雙酶法時間最長。第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、糖蜜原料的處理1、糖蜜的來源與特點

甘蔗糖廠的副產(chǎn)物甜菜糖廠的副產(chǎn)物2、糖蜜原料的處理（1）降低生物素含量：活性碳或樹脂吸附、亞硝酸破壞等（2）添加青霉素（3）添加表面活性劑等第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日

11.2.2谷氨酸生產(chǎn)菌及擴大培養(yǎng)一、生產(chǎn)菌經(jīng)過鑒定和命名的谷氨酸生產(chǎn)菌很多，其中主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細菌。它們都有以下共同特點：①菌體為球形、短桿至棒狀，②無鞭毛、不運動，③不形成芽孢，④呈革蘭氏陽性，⑤需要生物素做生長因子，⑥在通氣條件下培養(yǎng)能產(chǎn)生谷氨酸。第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、菌種的擴大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的瓊脂培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)18-24h。

國內(nèi)谷氨酸發(fā)酵種子擴大培養(yǎng)普遍采用二級種子培養(yǎng)的流程，即：斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日一級種子的常用培養(yǎng)基配方第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日種子的質(zhì)量要求:鏡檢菌體健壯，排列整齊，大小均勻二級種子的活菌濃度要求達到108～109個/ml要求二級種子活力旺盛平板檢驗，菌落淡黃色，呈半透明狀小搖瓶發(fā)酵試驗，產(chǎn)酸穩(wěn)定并在高峰第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日11.3發(fā)酵機制及工藝控制一、由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、葡萄糖合成谷氨酸的代謝途徑第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、生物合成途徑葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP途徑）和己糖磷酸支路（HMP途徑）生成丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶A（乙酰CoA），然后進入三羧酸循環(huán)，再通過乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4＋存在的條件下，生成谷氨酸。第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機制1、糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對糖代謝的調(diào)節(jié)：（1）對EMP和HMP途徑比例的影響（2）對糖代謝速度的影響（3）對乙醛酸循環(huán)的影響2、氮代謝的調(diào)節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不轉(zhuǎn)化成其他的氨基酸和參與蛋白質(zhì)的合成。第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日

生物素亞適量時，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶，又由于α-酮戊二酸脫氫酶的缺失，TCA循環(huán)被阻斷，使ATP大量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成停滯，在NH4＋適量時，合成谷氨酸并積累。3、細胞膜透性的調(diào)節(jié)（1）控制磷脂的合成導(dǎo)致形成磷脂合成不足的不完全細胞膜。方法有4種：①選育生物素缺陷型菌株，限制培養(yǎng)基中生物素的濃度；第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日②選育油酸缺陷型菌株，限制培養(yǎng)基中油酸的濃度；③選育甘油缺陷型菌株，限制培養(yǎng)基中甘油的濃度；④添加表面活性劑（如吐溫60）或高級飽和脂肪酸（C16-18）。

（2）控制細胞壁的合成導(dǎo)致形成不完全的細胞壁進而導(dǎo)致形成不完全的細胞膜。方法是在培養(yǎng)基中添加青霉素。第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日4、環(huán)境因素引起的谷氨酸發(fā)酵的代謝轉(zhuǎn)換第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日五、谷氨酸發(fā)酵的工藝控制

1.菌齡及接種量的控制一般情況下，一級種子菌齡控制在11～12h，二級種子菌齡控制在7～8h

接種量0.6％～1.7％。發(fā)酵培養(yǎng)基成份不同，谷氨酸菌種種類性質(zhì)、種齡不同，所用接種量也不同，應(yīng)根據(jù)實際情況和實驗情況具體確定。一般以1%為好。第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.溫度的控制

前期32±0.6℃，后期可提高到34～37℃。谷氨酸發(fā)酵前期，主要是長菌階段，如果溫度過高，菌種易衰老，嚴(yán)重影響菌體生長繁殖。因此，溫度控制在谷氨酸最適生長溫度32℃左右。在發(fā)酵后期，菌體生長基本結(jié)束，為了滿足大量生成谷氨酸，可適當(dāng)提高溫度，控制在34～37℃。第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.pH的控制發(fā)酵前期如果pH偏低，則菌體生長旺盛，長菌而不產(chǎn)酸；如果pH偏高，則菌體生長緩慢，發(fā)酵時間拉長。在發(fā)酵前期將pH值控制在7.5～8.0左右較為合適，而在發(fā)酵中、后期將pH值控制在7.0～7.6左右對提高谷氨酸產(chǎn)量有利。通常采用氨水流加法和尿素流加法調(diào)節(jié)pH，這樣同時也是添加氮源。第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日4.通風(fēng)量與攪拌速度的控制在長菌階段，若供氧過量，在生物素限量的情況下，抑制菌體生長，表現(xiàn)為耗糖慢，長菌慢，所以發(fā)酵前期以低通風(fēng)量為宜。在發(fā)酵階段，若供氧不足，發(fā)酵的主產(chǎn)物由谷氨酸變?yōu)槿樗?，所以發(fā)酵中、后期以高通風(fēng)量為宜。實際生產(chǎn)上，以氣體轉(zhuǎn)子流量計來檢查通氣量，即以每分鐘單位體積的通氣量表示通風(fēng)強度。另外發(fā)酵罐大小不同，所需攪拌轉(zhuǎn)速與通風(fēng)量也不同。第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日11.4谷氨酸的提取工藝一、谷氨酸發(fā)酵液的性質(zhì)在發(fā)酵液中，除含谷氨酸外，還存在菌體、殘?zhí)?、色素、膠體物質(zhì)及其他發(fā)酵副產(chǎn)物。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液的溫度在34~36℃，pH為6.0~7.5，接近中性；發(fā)酵液外觀呈淺黃色漿狀，表面浮有少許泡沫。第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、谷氨酸的提取方法

谷氨酸的分離提純主要根據(jù)它的兩性電解質(zhì)性質(zhì)、溶解度、分子大小、吸附劑的作用及谷氨酸的成鹽作用等，把它從發(fā)酵液中提取出來。目前提取谷氨酸的常用方法有等電點法、離子交換法、鋅鹽法等。隨著科技的進步，電滲析、反滲透、納濾膜等這些新技術(shù)也應(yīng)用到了谷氨酸的提取中。第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日1.等電點法等電點法是谷氨酸提取方法中最簡單的一種，它具有操作簡便、設(shè)備簡單等優(yōu)點，是目前谷氨酸生產(chǎn)多采用的方法。第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日（1）原理

谷氨酸分子中含有兩個酸性羧基和一個堿性氨基，在酸性條件下，即pH＜3.22時，α-羧基的電離受抑制，谷氨酸主要以陽離子形式存在，帶正電荷；當(dāng)pH＞3.22時，谷氨酸主要以陰離子形式存在，帶負電荷；當(dāng)pH＝3.22時（即等電點pI），谷氨酸凈電荷為零，呈電中性，而此時其溶解度最小，會從溶液中析出，通過過濾、離心等可提取出谷氨酸。第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日（2）谷氨酸的晶型及性質(zhì)谷氨酸晶體有兩種，分別是α-型和β-型。前者為斜方六面體，晶軸長短接近，晶體粗壯，顆粒大，純度高，易沉淀分離，是理想晶體。后者晶軸長短不一，針狀或鱗片狀，晶粒微細，不易沉淀析出，所以在操作中，需控制條件以利于形成α-型。第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日（3）谷氨酸提取的工藝流程第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日（4）提取工藝控制①谷氨酸含量：用等電點法提取谷氨酸時，要求谷氨酸含量在4％以上，否則可以先濃縮或加晶種后，再提取。②結(jié)晶溫度及降溫速度：谷氨酸的溶解度隨溫度降低而降低，為了利于形成α-型晶體，溫度要低于30℃，且降溫速度要慢。

第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日③加酸：加酸主要為了調(diào)節(jié)溶液pH至等電點，在操作時前期加酸稍快，中期（晶核）形成前要緩，后期加酸要慢，直至降至pI。④投晶種與育晶：加入一定量晶種，有利于提高谷氨酸收率。通常谷氨酸含量在5％、pH4.0～4.5時，加入晶種；谷氨酸含量在3.5％～4.0％、pH3.5～4.0時投放晶種，投放量約為發(fā)酵液的0.2～0.3％。第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日⑤攪拌：在結(jié)晶過程中，攪拌有利于晶體的長大，但也不易過強，否則還會使晶體破碎，一般以20～30r/min為宜。⑥離心分離：谷氨酸發(fā)酵液經(jīng)等電攪拌后，靜置4～6h，谷氨酸晶體大多沉淀在設(shè)備底部，上清液（母液）再回收利用，而底部的固形物通過離心的方法得到谷氨酸粗品。第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.其它方法（1）離子交換法：離子交換用強酸型陽離子交換樹脂（732﹟）氫型吸附谷氨酸形成的陽離子后，再用60℃，4％的NaOH洗脫，收集相應(yīng)流分，再加鹽酸結(jié)晶。（2）鋅鹽法：利用谷氨酸鋅在水溶液中的溶解度低的原理，將發(fā)酵液中的谷氨酸一次進行回收。第五十頁，共五十六頁，2022年，8月28日11.5味精的生產(chǎn)

從發(fā)酵液中提取到的谷氨酸，僅僅是味精生產(chǎn)的半成品。谷氨酸與適量堿作用，生成谷氨酸一鈉，其溶液經(jīng)過脫色、除鐵、除雜，最后通過減壓濃縮、結(jié)晶及分離，得到較純的谷氨酸一鈉晶體，不僅酸味消失，而且有很強的鮮味，這就是味精。如果谷氨酸與過量的堿作用，生成二鈉鹽，就不具有味精的鮮味。第五十一頁，共五十六頁，2