定量聚合酶鏈反應(yīng)測定技術(shù)詳解演示文稿

定量聚合酶鏈反應(yīng)測定技術(shù)詳解演示文稿第一頁，共四十八頁。優(yōu)選定量聚合酶鏈反應(yīng)測定技術(shù)第二頁，共四十八頁。第三頁，共四十八頁。什么是PCR?

我不認為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說明?！陌l(fā)明并沒有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過是一種新工具?！獎P利·穆利斯（KaryMullis)第四頁，共四十八頁。第五頁，共四十八頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實驗）發(fā)明了PCR。第六頁，共四十八頁。PCR發(fā)明過程的簡單回顧第七頁，共四十八頁。第八頁，共四十八頁。第九頁，共四十八頁。第十頁，共四十八頁。第十一頁，共四十八頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）1985關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)第十二頁，共四十八頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術(shù)專利批準。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個PCR試劑產(chǎn)品及第一臺熱循環(huán)儀。1989Science報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應(yīng)用于臨床診斷。第十三頁，共四十八頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）1990Cetus科學(xué)家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。第一個PCR試劑盒用于HLA定量檢測分析。Cetus科學(xué)家H.Erlich和K.Mullis在德國臨床化學(xué)領(lǐng)域獲得生化分析獎。1991TaqMan技術(shù)發(fā)表。當(dāng)年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權(quán)。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進行RT-PCR技術(shù)，并用于臨床RNA病毒檢測。耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶首次由Cetus科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并報道。

第十四頁，共四十八頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（5）1992當(dāng)年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標準試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎。第十五頁，共四十八頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（6）

九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年實時熒光PCR技術(shù)開始在中國較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測1999年西方發(fā)達國家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查第十六頁，共四十八頁。PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列第十七頁，共四十八頁。PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’第十八頁，共四十八頁。PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第十九頁，共四十八頁。第1個PCR循環(huán)完成后–

得到兩個拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin第二十頁，共四十八頁。30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第二十一頁，共四十八頁。第二十二頁，共四十八頁。PCR擴增過程圖示第二十三頁，共四十八頁。PCR擴增的理論模式

PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴增過程即由指數(shù)擴增降低至穩(wěn)定的擴增速率，最終達到平臺，不再擴增.第二十四頁，共四十八頁。影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應(yīng)試劑的相對量樣本在擴增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低第二十五頁，共四十八頁。PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴增分子的數(shù)目n : 擴增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysis第二十六頁，共四十八頁。定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別

定量PCR測定的測定點為PCR擴增的指數(shù)擴增期;而定性PCR測定的測定點則多為PCR擴增的平臺期。第二十七頁，共四十八頁。定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標方法、動力學(xué)方法和內(nèi)標共擴增方法定量還可分為絕對定量（即測定X的分子數(shù)量）和相對定量（即測定不同樣本中X的比率）

第二十八頁，共四十八頁。用外標準的定量PCR方法第二十九頁，共四十八頁。使用外標的定量PCR方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）方法簡便，容易建立；（2）使用雙孔重復(fù)測定，這種方法可得到非常準確的結(jié)果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點：（1）PCR反應(yīng)體系中小的區(qū)別也會對測定造成較大的影響。由于最后在擴增效率上的差異，從而使得定量測定精密度和重復(fù)性不佳。因此，如果建立一個使用外標準的PCR定量方法，則必須進行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以確定其應(yīng)用的局限性。第三十頁，共四十八頁。TaqMan實時熒光定量PCR第三十一頁，共四十八頁。第三十二頁，共四十八頁。分子信標實時熒光定量PCR第三十三頁，共四十八頁。動力學(xué)定量PCR方法

第一步：確定PCR擴增的效率；第二步：根據(jù)相應(yīng)的公式計算原始模板數(shù)。第三十四頁，共四十八頁。擴增效率的計算(1)如果在PCR每一個擴增循環(huán)中擴增效率為常數(shù)，則可通過在PCR擴增的指數(shù)期的數(shù)個連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴增樣本，然后測定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來測定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴增效率保持恒定；換句話說，也就是PCR尚未達到擴增效率開始降低時的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測得E值；第三十五頁，共四十八頁。擴增效率的計算第三十六頁，共四十八頁。擴增效率的計算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)第三十七頁，共四十八頁。X(原始模板數(shù))的計算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計算得到X。公式（4）來源于公式（2）的重新排列：X＝Y(jié)n/(1＋E)n（4）第三十八頁，共四十八頁。X的另一種計算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對數(shù)形式，以所測定的Yn值的對數(shù)對函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當(dāng)n＝0時，可在圖上讀出X值，或通過對公式（5）的線性回歸計算X值（圖2）。第三十九頁，共四十八頁。第四十頁，共四十八頁。動力學(xué)方法的特點

這種方法的優(yōu)點:(1)不需要外標準；（2）如果能測定PCR產(chǎn)物分子的絕對數(shù)量，則可得到待測樣本的不同的擴增效率（Ee)。第四十一頁，共四十八頁。使用非競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法

非競爭性內(nèi)標準：（1）一般為與靶核酸無關(guān)的基因組；（2）既可是內(nèi)源的也可是外源的；（3）與靶核酸無相同的引物結(jié)合位點和擴增序列。對于DNA的擴增，非競爭性內(nèi)標幾乎所有的基因都可應(yīng)用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動蛋白的基因。而對RNA的擴增，則非競爭性內(nèi)標較難尋找。理想的mRNA內(nèi)標應(yīng)該在整個細胞周期中表達的水平變化不大，此外，其表達水平應(yīng)接近于靶RNA，而且它們的擴增效率應(yīng)相等，因此兩者擴增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來作為此種內(nèi)標，如HLA、β肌動蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。第四十二頁，共四十八頁。以非競爭性內(nèi)標定量的主要優(yōu)點內(nèi)標的制備簡單復(fù)管測定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。第四十三頁，共四十八頁。以非競爭性內(nèi)標定量的缺點內(nèi)標準和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對的是相同的靶核酸逆轉(zhuǎn)錄效率也會有很大差異。因此，使用這種方法進行RNA的定量PCR測定極為困難。在擴增過程中的指數(shù)期測定可對原始模板相對定量，但如果沒有驗證在一定的擴增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標有相同的擴增效率，則不能進行絕對定量。第四十四頁，共四十八頁。使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法

“競爭性”內(nèi)標：人為構(gòu)建的可與原始靶核酸競爭酶、核苷酸和引物分子的核酸標準，其特點是，與靶核酸具有相同的引物結(jié)合位點、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴增產(chǎn)物在檢測時能夠很容易地通過諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對內(nèi)標準的修飾方法包括對野生型基因組的點突變、部份缺失或插入外來順序等，目前尚無通用的規(guī)則或程序來構(gòu)建這種內(nèi)標準。第四十五頁，共四十八頁。使用競爭性內(nèi)標準的定量PCR方法使用競爭性內(nèi)標既可進行相對定量也可進行絕對定量。相對定量具有很好的精密度和重復(fù)性。而絕對定量，關(guān)鍵是要證明競爭性內(nèi)標和野生型靶核酸的擴增效率相同。亦可將競爭性內(nèi)標置于含已知量的野生型靶