評(píng)估轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)12.開(kāi)題說(shuō)明2011hsx

Ndrg家族在小鼠腦發(fā)育中的

時(shí)空表達(dá)及作用

導(dǎo)師：鄧艷春教授指導(dǎo)教師：史明博士博士生：侯雙興研究背景ndrg家族結(jié)構(gòu)

哺乳動(dòng)物ndrg1、2、3、4

同源性57%～65%，—α/β水解酶折疊域—?；鶖y帶蛋白樣結(jié)構(gòu)域

—5′端CPG島-—DNA甲基化

ndrg家族功能—與細(xì)胞的增殖、分化相關(guān)—與組織異常分化相關(guān)—不同組織差異表達(dá)—不同成員在腦組織差異表達(dá)

ndrg家族組織表達(dá)Ndrg在腦細(xì)胞內(nèi)表達(dá)大腦ndrg1、寡突膠質(zhì)細(xì)胞、ndrg2星形膠質(zhì)細(xì)胞ndrg3、4各種腦細(xì)胞小腦ndrg1、4浦肯野氏細(xì)胞ndrg2伯格翰膠質(zhì)細(xì)胞ndrg3各種腦細(xì)胞核

Ndrg2與ndrg4堿基序列有一定相關(guān)性，但在AD等腦病表達(dá)差異,ndrg2與抑郁相關(guān)，抗抑郁治療增強(qiáng)表達(dá)NDRG1細(xì)胞分化維甲酸N++tumor雄激素HMSNL病白血病

缺氧、應(yīng)激DNA損傷NDRG2阿茲海默病糖皮質(zhì)激素腦卒中癲癇腫瘤電驚厥治療抗抑郁治療(BrainRes,2005)

（AnnNYAcadSci,2003）

（BrainRes,2003）

（

IntJCancer,2003）

（

IntJCancer,2003）

（IntJNeuropsychopharmacol,2005）（中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011）Ndrg1、2發(fā)現(xiàn)較早，功能研究較多。Ndrg3、4近些年陸續(xù)有報(bào)道，多與細(xì)胞分化、抑癌相關(guān)。結(jié)構(gòu)上ndrg1、2相似，3、4接近。細(xì)胞表達(dá)ndrg1、4相似，2、3相似前期工作Ndrg家族在成人各組織差異表達(dá)Ndrg家族與組織分化狀態(tài)相關(guān)Ndrg2在胎腦中的時(shí)空表達(dá)Ndrg2在小鼠呼吸系統(tǒng)發(fā)育期表達(dá)特點(diǎn)Ndrg2在小鼠胚胎及出生后腦神經(jīng)

發(fā)生區(qū)表達(dá)Ndrg2在胚胎腦神經(jīng)發(fā)生區(qū)的表達(dá)

Hi海馬Met后腦Tel

端腦SC脊髓Drg背根神經(jīng)節(jié)DT背側(cè)丘腦Mes中腦CB小腦Cx

大腦皮層

Ndrg2在胚胎腦區(qū)的空間定位VZ腦室層CP皮層板SVZ腦室下層IZ

中間層MZ

邊緣層ET

上丘腦

DT

背側(cè)丘腦Ndrg2在神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)LV側(cè)腦室Ndrg2在神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)Ndrg2在神經(jīng)干細(xì)胞有表達(dá)結(jié)果：Ndrg2在VZSVZRMS表達(dá)Cc胼胝體Str紋狀體LV側(cè)室結(jié)果：Ndrg2在VZ,SVZ,RMS表達(dá)DCX標(biāo)記神經(jīng)元前體細(xì)胞結(jié)果：Ndrg2在神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)結(jié)果：Ndrg2在海馬SGZ層表達(dá)Hi海馬GCL顆粒細(xì)胞層SGZ顆粒下層Th丘腦結(jié)果：Ndrg2在小腦的表達(dá)

EGL外顆粒層PCL蒲肯野細(xì)胞層

IGL內(nèi)顆粒層INB內(nèi)成神經(jīng)細(xì)胞層ONB外成神經(jīng)細(xì)胞層結(jié)果：Ndrg2在內(nèi)成神經(jīng)細(xì)胞層有表達(dá)

但是BrdU陽(yáng)性在外成神經(jīng)細(xì)胞層DorsalVentral結(jié)果：Ndrg2在脊髓腹側(cè)表達(dá)但是BrdU陽(yáng)性在脊髓背側(cè)Dorsal背側(cè)Ventral腹側(cè)

Ndrg2在20、28周延髓表達(dá)研究基礎(chǔ)與工作條件

對(duì)ndrg2基因功能研究的初步結(jié)果Ndrg2與組蛋白乙?；?/p>

TSA可能是通過(guò)提高ndrg2的表達(dá)，從而提高組蛋白乙酰化水平，引起細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。由此得出ndrg2可能參與組蛋白乙?；^(guò)程的調(diào)節(jié)。ndrg2基因產(chǎn)物的生理功能：用大腸桿菌表達(dá)了人的ndrg2cDNA，用純化產(chǎn)物免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選，獲得了可以用于蛋白印記和免疫組化分析的單克隆抗體。ndrg2抑制多種瘤細(xì)胞的增殖:1)ndrg2轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)其可抑制這兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖。

2)ndrg2短基因轉(zhuǎn)染抑制肺癌/胃癌、肝癌等細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡技術(shù)條件目前已合成ndrg2探針，ndrg3、4質(zhì)粒；ndrg1質(zhì)粒合成中。本室已具備原位雜交技術(shù)全部設(shè)備，依托基礎(chǔ)部生化、神解、神生技術(shù)及設(shè)備可完成全部實(shí)驗(yàn)。本人在實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)協(xié)助下，可完成各項(xiàng)技術(shù)操作。研究?jī)?nèi)容

NDRG家族可能是腦發(fā)育期間

幼稚神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分裂

增殖前移和成熟的重要調(diào)節(jié)物ndrg功能預(yù)測(cè)氨基酸序列軟件分析：NDRG-/水解酶類蛋白

NDRG2---胞質(zhì)蛋白，21.7％出現(xiàn)于細(xì)胞核的可能性，并存在疏水跨膜區(qū)，有利向核內(nèi)遷移研究目標(biāo)在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中，利用生物標(biāo)記研究ndrg家族在小鼠腦發(fā)育的表達(dá)特點(diǎn)，探討ndrg成員在腦發(fā)育中相互關(guān)系及機(jī)制。明確基因敲除ndrg后，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能影響，為進(jìn)一步研究其功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)一Ndrg在小鼠腦發(fā)育中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)二基因敲除Ndrg對(duì)腦發(fā)育影響實(shí)驗(yàn)一ndrg家族在小鼠腦發(fā)育

過(guò)程中的表達(dá)RT-PCR——胚胎期、出生后小鼠發(fā)育過(guò)程中NDRGmRNA表達(dá)水平的變化原位雜交——全胚胎及生后不同階段ndrg在腦中的分布和表達(dá)量的變化.

Ndrg1、2、3、4探針制備750500RT-PCR膠回收連接pGEM-T載體轉(zhuǎn)化、挑克隆提質(zhì)粒

PCR鑒定SacI酶切鑒定測(cè)序鑒定線性化質(zhì)粒Sp6轉(zhuǎn)錄、DIG標(biāo)記Ndrg2anti-sense探針探針純化100075010001000500取E10.5、E11.5、E12.5、E14.5、E16.5和E18.5的孕鼠（n=10）給予孕鼠腹膜內(nèi)注射BrdU（60mg/Kg）1.5h后斷頸處死孕鼠，取出鼠胚，

鼠胚胎用新鮮配制4%多聚甲醛固定12h，25%蔗糖脫水12h后，冰凍切片實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

冰凍切片原位雜交法切片的預(yù)處理增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性減低背景染色

雜交洗片和顯影

實(shí)驗(yàn)二ndrg基因敲除

對(duì)腦發(fā)育的影響

用Cre重組酶行組織特異性條件基因剔除ndrg條件基因剔除載體構(gòu)建及LoxP位點(diǎn)

有效性鑒定

以ECL檢測(cè)試劑盒(Amersham)檢測(cè)，檢測(cè)NDRG,Bmi一1，p16，p19，p21，p53等基因

蛋白產(chǎn)物具體技術(shù)路線見(jiàn)下圖擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題

ndrg與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育成熟生物標(biāo)記ndrg基因敲除，小鼠是否顯示出現(xiàn)一系列表型變化，包括腦發(fā)育延緩，海馬區(qū)結(jié)構(gòu)異常及相關(guān)基因p16、p19、p21、p53

與腦發(fā)育相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平之間的差異特色與創(chuàng)新之處本實(shí)驗(yàn)采用全胚胎原位雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)系統(tǒng)觀察ndrg-mRNA和蛋白在神經(jīng)管發(fā)生和