簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法、原則（含詳細(xì)步驟）

3/3?簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法、原則（含詳細(xì)步驟）簡(jiǎn)并引物常用于從已知蛋白到相關(guān)核酸分子的研究及用于一組引物擴(kuò)增一類分子。

一，簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法1，利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質(zhì)或cDNA編碼的氨基酸序列因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核苷酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP（通過蛋白查蛋白），在整個(gè)NR數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相似的氨基酸序列。2，對(duì)所有的序列進(jìn)行多序列比對(duì)將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有ClustalW/X，也可在線分析。所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來(lái)。“*”表示保守，“：”表示次保守。3，確定合適的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50~400個(gè)氨基酸殘基為宜，使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)氨基酸的保守區(qū)，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)氨基酸序列的保守區(qū)，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣關(guān)系近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)，總之，究竟要選多少序列來(lái)比對(duì)，要根據(jù)前一次的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。4，利用軟件設(shè)計(jì)引物當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物了，其中Primer5.0支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)，將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入Primer5.0中，將其翻譯成核苷酸序列，該序列群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在Primer5.0中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。5，對(duì)引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則簡(jiǎn)并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度很高不利于PCR，可以通過次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤可以很好的和4種堿基配對(duì)）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來(lái)降低簡(jiǎn)并度。這樣設(shè)計(jì)出來(lái)的簡(jiǎn)并引物對(duì)，適用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。二，簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則從蛋白到核酸，請(qǐng)注意：（1）盡量選擇簡(jiǎn)并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)，如蛋氨酸和色氨酸僅有一個(gè)密碼子。（2）充分注意物種對(duì)密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。（3）引物不要終止于簡(jiǎn)并堿基，對(duì)大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō)，意味著引物的3末端不要位于密碼子的第三位。（4）在簡(jiǎn)并度低的位置，可用次黃嘌呤（dI）代替簡(jiǎn)并堿基。以上幾點(diǎn)遵循的總的原則為：盡量降低引物的簡(jiǎn)并度，尤其在3'末端或近3'末端。由于引物的簡(jiǎn)并性的問題，所設(shè)計(jì)的引物通常簡(jiǎn)并性過高，導(dǎo)致有效引物利用率降低，PCR產(chǎn)物非特異性增高。雖然減少簡(jiǎn)并引物長(zhǎng)度可以相對(duì)減少簡(jiǎn)并性，但隨之而來(lái)的問題是引物的Tm值過低，有時(shí)不得不設(shè)計(jì)第二對(duì)引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，即巢式PCR，或者需要與TouchdownPCR相結(jié)合使用。與通常設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物不同，利用CodeHop方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。引物由兩部分組成：引物3’端為根據(jù)4-5個(gè)保守氨基酸設(shè)計(jì)的核心簡(jiǎn)并區(qū)(3’coreregion)，長(zhǎng)度只有11-15個(gè)堿基;引物5’端為非簡(jiǎn)并性?shī)A板結(jié)構(gòu)(5’consensusclampregion)。5’端夾板結(jié)構(gòu)是根據(jù)密碼子偏向性設(shè)計(jì)的一致性序列，它最大程度的預(yù)測(cè)了保守性氨基酸的編碼序列，其長(zhǎng)度取決于所需的退火溫度。這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于既減少了引物的簡(jiǎn)并度，又提高了引物的退火溫度，保障了PCR產(chǎn)物的特異性。標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)并PCR在聚合反應(yīng)的晚期，隨著產(chǎn)