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3/3?簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法、原則(含詳細(xì)步驟)簡(jiǎn)并引物常用于從已知蛋白到相關(guān)核酸分子的研究及用于一組引物擴(kuò)增一類分子。
一,簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法1,利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質(zhì)或cDNA編碼的氨基酸序列因?yàn)槊艽a子的關(guān)系,不同的核苷酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的,所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng),查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP(通過蛋白查蛋白),在整個(gè)NR數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相似的氨基酸序列。2,對(duì)所有的序列進(jìn)行多序列比對(duì)將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì),可選工具有ClustalW/X,也可在線分析。所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來(lái)。“*”表示保守,“:”表示次保守。3,確定合適的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域,且兩個(gè)保守區(qū)域相距50~400個(gè)氨基酸殘基為宜,使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間,最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)氨基酸的保守區(qū),因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)氨基酸序列的保守區(qū),這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系,選擇親緣關(guān)系近的物種進(jìn)行二次比對(duì),若保守性仍達(dá)不到要求,則需進(jìn)行三次比對(duì),總之,究竟要選多少序列來(lái)比對(duì),要根據(jù)前一次的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。4,利用軟件設(shè)計(jì)引物當(dāng)?shù)玫奖J貐^(qū)域后,就可以利用專業(yè)的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物了,其中Primer5.0支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì),將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入Primer5.0中,將其翻譯成核苷酸序列,該序列群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示(其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C,K=G/T,S=C/G,W=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T,該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分,在Primer5.0中修改參數(shù),令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì),總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi),結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì),分?jǐn)?shù)越高越好。5,對(duì)引物的修飾若得到的引物為:5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則簡(jiǎn)并度=4×2×4×3×4×3×2=2304,很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度很高不利于PCR,可以通過次黃嘌呤代替N(因?yàn)榇吸S嘌呤可以很好的和4種堿基配對(duì))和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來(lái)降低簡(jiǎn)并度。這樣設(shè)計(jì)出來(lái)的簡(jiǎn)并引物對(duì),適用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。二,簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則從蛋白到核酸,請(qǐng)注意:(1)盡量選擇簡(jiǎn)并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū),如蛋氨酸和色氨酸僅有一個(gè)密碼子。(2)充分注意物種對(duì)密碼子的偏好性,選擇該物種使用頻率高的密碼子,以降低引物的簡(jiǎn)并性。(3)引物不要終止于簡(jiǎn)并堿基,對(duì)大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō),意味著引物的3末端不要位于密碼子的第三位。(4)在簡(jiǎn)并度低的位置,可用次黃嘌呤(dI)代替簡(jiǎn)并堿基。以上幾點(diǎn)遵循的總的原則為:盡量降低引物的簡(jiǎn)并度,尤其在3'末端或近3'末端。由于引物的簡(jiǎn)并性的問題,所設(shè)計(jì)的引物通常簡(jiǎn)并性過高,導(dǎo)致有效引物利用率降低,PCR產(chǎn)物非特異性增高。雖然減少簡(jiǎn)并引物長(zhǎng)度可以相對(duì)減少簡(jiǎn)并性,但隨之而來(lái)的問題是引物的Tm值過低,有時(shí)不得不設(shè)計(jì)第二對(duì)引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增,即巢式PCR,或者需要與TouchdownPCR相結(jié)合使用。與通常設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物不同,利用CodeHop方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。引物由兩部分組成:引物3’端為根據(jù)4-5個(gè)保守氨基酸設(shè)計(jì)的核心簡(jiǎn)并區(qū)(3’coreregion),長(zhǎng)度只有11-15個(gè)堿基;引物5’端為非簡(jiǎn)并性?shī)A板結(jié)構(gòu)(5’consensusclampregion)。5’端夾板結(jié)構(gòu)是根據(jù)密碼子偏向性設(shè)計(jì)的一致性序列,它最大程度的預(yù)測(cè)了保守性氨基酸的編碼序列,其長(zhǎng)度取決于所需的退火溫度。這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于既減少了引物的簡(jiǎn)并度,又提高了引物的退火溫度,保障了PCR產(chǎn)物的特異性。標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)并PCR在聚合反應(yīng)的晚期,隨著產(chǎn)
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