實(shí)習(xí)二細(xì)胞存活曲線測試與結(jié)果分析

實(shí)習(xí)二細(xì)胞存活曲線測試與結(jié)果分析一、目的要求實(shí)習(xí)目的是了解克隆形成法檢測細(xì)胞存活曲線實(shí)驗(yàn)方法的原理與基本步驟，熟悉細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與受照劑量（Gy）之間的劑量一效應(yīng)關(guān)系，以及與存活曲線結(jié)果分析處理有關(guān)的軟件使用，掌握細(xì)胞存活曲線的測試、繪制與結(jié)果分析的正確方法。具體要求：1,計(jì)算細(xì)胞接種效率PE；2,應(yīng)用SPSS軟件計(jì)算單擊多靶模型下不同的n和k值，正確閱讀運(yùn)算結(jié)果；3,根據(jù)實(shí)際獲得的n和k值，進(jìn)一步計(jì)算出D、Dq和D值，以及增敏比SER；4,利用EXCEL軟件計(jì)算出不同劑量照0 37射下細(xì)胞的理論存活分?jǐn)?shù)預(yù)測值，繪制存活分?jǐn)?shù)預(yù)測值與照射劑量間的劑量效應(yīng)曲線。二、 實(shí)驗(yàn)原理放射生物學(xué)中細(xì)胞死亡是指細(xì)胞喪失完整增殖能力的一種死亡。當(dāng)細(xì)胞受到電離輻射照射后，受照細(xì)胞可呈現(xiàn)“間期死亡”，或曰即刻死亡，也可能呈現(xiàn)為“增殖性死亡”，即受照細(xì)胞形態(tài)上仍然保持完整，而且有能力制造蛋白質(zhì)、合成DNA，甚至還能再經(jīng)過一次或n次有絲分裂后，才突然變性死亡。鑒于上述細(xì)胞死亡定義和照射后細(xì)胞死亡的實(shí)際情況，細(xì)胞放射生物學(xué)通常采用細(xì)胞克隆（集落）形成試驗(yàn)來檢測照射后細(xì)胞的存活狀況。細(xì)胞克隆是在體外培養(yǎng)時(shí)由一獨(dú)立的單個(gè)健康存活細(xì)胞直接分裂增殖而形成的細(xì)胞群體。在計(jì)數(shù)克隆數(shù)目時(shí)，通常把含50個(gè)以上細(xì)胞的克隆計(jì)為一個(gè)細(xì)胞集落，代表一個(gè)存活細(xì)胞。在描述細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF,survivalfraction）與電離輻射吸收劑量（Dose,Gy）間的定量關(guān)系時(shí)，通常有單擊單靶和單擊多靶兩種模型。而哺乳類細(xì)胞受照后存活曲線多近似地符合單擊多靶模型。根據(jù)模型對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析可以獲得細(xì)胞存活曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式及其具有生物學(xué)意義的一些參數(shù)。例如在單擊多靶細(xì)胞克隆存活模型中，Dq值的大小反映細(xì)胞抵抗電離輻射修復(fù)亞致死損傷的能力。因此電離輻射細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)就是要通過檢測與擬合細(xì)胞存活曲線，獲得諸如D、Dq、k和n等一系列參數(shù)，從而根據(jù)這些參數(shù)對細(xì)胞的放射敏感性作出定0量的評價(jià)。三、 細(xì)胞存活曲線實(shí)驗(yàn)的基本步驟

細(xì)胞準(zhǔn)備與照射 細(xì)胞照射前，取體外培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。設(shè)假照射對照組和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0Gy7個(gè)照射組，每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)瓶。于25cm2培養(yǎng)瓶中，按劑量分組每瓶分別接種細(xì)胞100、200、400、1000、2000、4000、8000、16000個(gè)細(xì)胞，于37°C,5%CO下正常培養(yǎng)。2接種6-12小時(shí)后細(xì)胞已貼壁生長，將培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至鉆源室接受照射處理。其中，假照射對照組細(xì)胞不接受照射處理。rMlianuH^Huniwi- hl rMlianuH^Huniwi- hl 尋 ￡0imy; W細(xì)胞培養(yǎng)、克隆計(jì)數(shù)與平均存活分?jǐn)?shù)(SF)的計(jì)算將接受照射后的細(xì)胞放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每三天更換新鮮培養(yǎng)液一次。待培養(yǎng)至10-14天后棄去培養(yǎng)基，用0.5%結(jié)晶紫染色貼壁細(xì)胞。計(jì)數(shù)并記錄不同照射劑量下各組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞存活克隆個(gè)數(shù)。根據(jù)假照射處理組細(xì)胞克隆形成數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞接種效率(PE)；各照射處理組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)為各組細(xì)胞克隆形成的平均數(shù)除以相應(yīng)細(xì)胞接種數(shù)與接種效率的乘積。接種/(圉採種的細(xì)胞數(shù)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)與輻射劑量之間數(shù)學(xué)模型的建立哺乳細(xì)胞接受不同劑量的電離輻射照射后，細(xì)胞存活的規(guī)律大多是符合單擊多靶細(xì)胞存活模型，即SF=1-[1-EXP(-k*D)**n]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)測細(xì)胞存活數(shù)據(jù)進(jìn)行該數(shù)學(xué)模型的非線性回歸擬合分析，可獲得單擊多靶細(xì)胞存活模型的一系列有意義的參數(shù)，如k、n、D、D和Dq。其中，k為細(xì)胞存活曲線的鈍化常數(shù),0 37其值可由擬合曲線方程直接給出；n稱外推數(shù)，代表理論上的靶數(shù)目，數(shù)值大小也是由擬合方程直接給出。D、D和Dq是根據(jù)k、n值演算出來的，D稱為平均0 37 0致死劑量，是理論上使每個(gè)細(xì)胞平均被擊中一次所需要的輻射劑量，數(shù)值上D0=l/k；Dq稱為準(zhǔn)閾劑量，表征修復(fù)亞致死損傷的能力，即克服單擊多靶曲線中“肩寬”的劑量，數(shù)值上Dq=lnnxD；D是細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為37%時(shí)相應(yīng)的輻0 37射劑量，在單擊多靶模型中D=D+Dq。細(xì)胞存活單擊多靶模型(下圖)的表37 0達(dá)式為：SF=l-(l-e-kD)nSPSS軟件對單擊多靶模型的數(shù)學(xué)擬合，求出模型中k和n參數(shù)值大致步驟如下：計(jì)算、整理不同輻射吸收劑量D下細(xì)胞的平均存活分?jǐn)?shù)SF(校正接種效率后的平均存活分?jǐn)?shù)，這是第一步)，制成劑量D與存活分?jǐn)?shù)SF的二維表格；啟動SPSS軟件，定義變量名D和SF、字段寬度以及小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)，將SF顯示精度定為小數(shù)點(diǎn)后4位數(shù)，并輸入D和SF的原始數(shù)據(jù)；選擇SPSS軟件中非線性回歸(Nonlinearregression)窗口，將SF設(shè)置為因變量(Dependent)，數(shù)學(xué)公式表達(dá)模型中輸入l-[l-EXP[-k*D]**n],同時(shí)將模型參數(shù)k和n迭代的起始值分別設(shè)置為0.0001，同時(shí)將模型參數(shù)k和n數(shù)值各自限制在大于或等于0.0001以內(nèi)，保存上述分析條件；迭代擬合的算法方式選擇levenburg-Marquadt,為繪制存活曲線圖方便，顯示項(xiàng)中選擇根據(jù)擬合方程計(jì)算出的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的理論預(yù)測值；執(zhí)行運(yùn)算并顯示出SPSS特有的結(jié)果文件。在運(yùn)算結(jié)果顯示文件中有不同迭代過程剩余的殘差平方和、根據(jù)l-[l-EXP[-k*D]**n]擬合后的最終優(yōu)選k和n參數(shù)值、以及k和n的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)概率等。最終優(yōu)選的k和n參數(shù)值最為重要，是我們模擬計(jì)算的目的。此節(jié)是本次實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)與難點(diǎn)，有關(guān)詳細(xì)過程可參考六、SPSS軟件使用指南參考。單擊多靶模型中D、Dq和D值，以及增敏比SER的計(jì)算0 37根據(jù)最終優(yōu)選的k和n參數(shù)值，我們可以進(jìn)一步計(jì)算出D0,D37和Dq，其相互之間的關(guān)系式如下：SP= 1—<1— 丄丄h—1IJQ丄=—1n11x-Z%+同一細(xì)胞株接受不同因素（如乏氧、增敏劑等）處理后再行照射，細(xì)胞存活曲線及其參數(shù)會發(fā)生變化，根據(jù)這些參數(shù)的變化我們還可進(jìn)一步計(jì)算出增敏比（sensitivityenhanceratio,SER），SER增敏比反映細(xì)胞放射敏感性的不同及其變化。SER一般大于或等于1,SER越大說明經(jīng)該試劑處理或缺氧后對輻射表現(xiàn)出更加敏感。SER=Dq（未接受化學(xué)處理或有氧情況下對照組）/Dq（接受化學(xué)處理或無氧情況下處理組）有研究表明，實(shí)體瘤細(xì)胞因缺血缺氧而表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Tun（衣霉素）具有抑制細(xì)胞內(nèi)糖蛋白的糖基化修飾，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。本次實(shí)習(xí)是利用Tun和另一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激試劑DTT一起對腫瘤細(xì)胞株HeLa細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再行電離輻射照射。因此本次實(shí)驗(yàn)我們要求同學(xué)利用附后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否具有增強(qiáng)輻射敏感性的作用提出評價(jià)，另外如若要做出此實(shí)驗(yàn)結(jié)論時(shí)您還希望要做的進(jìn)一步補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)是什么，請說明為什么。利用EXCEL軟件對細(xì)胞存活曲線的繪制 最終優(yōu)選的k和n參數(shù)值后除了可以進(jìn)一步計(jì)算單擊多靶模型中D、Dq和D值以及增敏比SER外，我們還要0 37求同學(xué)利用k和n參數(shù)值回代到該模擬公式中，對不同輻射劑量D下的存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行理論預(yù)測，然后利用理論預(yù)測的存活分?jǐn)?shù)SF值與實(shí)際給予的輻射劑量D之間繪制一條平滑的存活曲線。繪制過程大致步驟如下：啟動EXCEL軟件；輸入不同劑量值D；fx欄輸入=l-POWER[(l-EXP(-k*D),n]公式，其中k和n值換成來自SPSS模擬方程的計(jì)算結(jié)果，運(yùn)算各劑量組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)預(yù)測值；根據(jù)各組劑量值D與細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)SF預(yù)測值建立數(shù)據(jù)二維表；啟動繪圖XY散點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)模式，輸入標(biāo)題、縱橫軸名稱【如HeLa細(xì)胞伽瑪照射后存活曲線單擊多靶模型圖、SF、Dose(Gy)】，去掉網(wǎng)格線、圖背景陰影、圖例和線框；點(diǎn)擊Y軸坐標(biāo)軸，選刻度項(xiàng)，修改最小刻度0.01，最大刻度10，主要刻度10，次要刻度10，數(shù)軸交叉于0.001，選對數(shù)刻度；點(diǎn)擊各組各點(diǎn)，選數(shù)據(jù)系列格式，線型選自定義，線形平滑；圖幅大小設(shè)置5X20。獲得曲線圖之后，我們也可以在不同預(yù)測曲線上添加出實(shí)測存活分?jǐn)?shù)值，同學(xué)們由此可觀察到理論預(yù)測值與實(shí)際值之間的真實(shí)差異，這種差異也可以反映在運(yùn)算結(jié)果顯示文件中顯著性檢驗(yàn)分析上。四、實(shí)習(xí)作業(yè)演算練習(xí)，根據(jù)以下Tun和DTT組數(shù)據(jù)計(jì)算各自增敏比(SER)并作圖。cellseedingCTRsurvivalcellCTRmeancellTunsurvivalcellTunmeancellDTTsurvivalcellDTTsurvivalcellDosenumbernumbernumbernumbernumbernumbermean0600411390300060042742736506004424274424204323660.56002833622930.56003243493160.560021727528033029030011000322344353110002023803011100028827132735032432624000344492511240003574084582400034234860150054650568000260305300680002333242986800020323228130336332081000088122169

810000810000112851008100009498154120172147五、SPSS軟件使用指南參考:下面以原始數(shù)據(jù)進(jìn)行1-[1-EXP[-k*D]**n]非線性回歸方程擬合為例詳細(xì)講解SPSS軟件的使用。照射劑量與平均細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)原始數(shù)據(jù)整理如下：組別Dose(Gy)平均（SF）00.00計(jì)算PE用10.001.0022.000.7034.000.3046.000.1058.000.02第一步：啟動SPSS,定義變量名，并把SF顯示為精度4位數(shù)，便于和擬合數(shù)據(jù)比較??！其中定義變量名非常關(guān)鍵JDIX]FileEditViewQa斯TransformArtalyaeGraphsUtilitiesWindowHe^p-|O|X|囲JDIX]FileEditViewQa斯TransformArtalyaeGraphsUtilitiesWindowHe^p-|O|X|囲Untitled-SPSSDatdEditor凰UnUkd-SPSSDataEditorFileEditViewDataTransformAnalyseGraphsUtiMiesWindowHelp色副昌I團(tuán)討“曰吋州刊罰目圭|珂舸@|varvarvar土|wi1.oooo22.00.700034W300046.001.10?58O0f.0200bitaVie<^VariableView/|—?止SPSSProcessorisready第二步： 、 、激活A(yù)nalysis菜單選Regression中Nonlinear...項(xiàng)，彈出NonlinearRegression對話框，依次進(jìn)行如下圖中操作，其中ModelExpression的選項(xiàng)非常關(guān)鍵,本例為1-(1-EXP(-k*D))**N

第三步：點(diǎn)擊上圖中Parameters,出現(xiàn)下面的對話框,進(jìn)行如下圖的設(shè)置:NonlinearRegression:ParameterConstraints0.0001N(O.DQ01)_d~l_J丄JIA0.C0O1IJ_1JDob刷Chancje|Berndve|色dd赳口nlinearRegresfiion:ParameterlZonfi：l:raini-?Fararn&terc:[kiO.DCiC-i)LUnconstrained0.0001N(O.DQ01)_d~l_J丄JIA0.C0O1IJ_1JDob刷Chancje|Berndve|色dd赳口nlinearRegresfiion:ParameterlZonfi：l:raini-?Fararn&terc:[kiO.DCiC-i)LUnconstrained c?GDefineparameterconstraint:乏L^「/JalSi_14i5161JjE11]'2]2|01.11JDeletfiff'.k>=0.0001AddChange「RerTiove第四步：打開限定條件對話框后，依次進(jìn)行如下圖的設(shè)置，至于為什么要進(jìn)行這種限定，以及這樣限定的合理性，簡單解釋:k肯定大于0,N也肯定大于0,所以就設(shè)置他們都大于一個(gè)很小的數(shù)字吧，這樣設(shè)置的巧妙性在于避免SPSS擬合過程中出現(xiàn)諸如（-3廠2.5這樣的死步驟。給好限定條件后，會跳出一個(gè)框子提醒你什么什么什么，不管他，繼續(xù)望下走2SJ-SequentialQuadraticP/ogr￡nnming—MswinfrurnrSteplirri十廠|d血◎忙:FunclicnpreciaoTr臥!2SJ-SequentialQuadraticP/ogr￡nnming—MswinfrurnrSteplirri十廠|d血◎忙:FunclicnpreciaoTr臥!iTEnfirvltestep|lE+20jJLevenbefg-MarquadtMaximumitgration監(jiān)Sum^af^s^uaiesconvergence:ParameJetconvergencerBootstrapestimatesolstandardeiroiEstimationMethod「SequentialquadraticpiogrsmmingjLeverberg-MarqLjardtjlE-3_^J|IE8ContinueCancelHelp|顯示項(xiàng)中選擇根據(jù)擬合方程計(jì)算出的細(xì)胞克隆理論存活分?jǐn)?shù)預(yù)測值；迭代擬合的算法方式選擇levenburg-Marquadt,保存各種所選條件等NonlinearRegression:Options第五步：回到擬合界面對話框后,依次進(jìn)行下圖操作，目的是根據(jù)擬合方程顯示理論預(yù)測值，其中擬合算法很關(guān)鍵,請一定要按照圖中所示進(jìn)行，最后點(diǎn)擊OK。一切結(jié)果就顯示出來啦??！

ConstrainedNonlinearRegressionAllthederivativeswillbecalculatednumerically.Thefollowingnewvariablesarebeingcreated:NameLabelPRED_PredictedValuesIterationResidualSSkN0.1.5885643726.000100000.0001000001.1.4326928450.000100000.0102676592.1.2644240765.000100000.0322631473.2.2460533309.000100000.0406662214.1.2353237999.000550799.0585760005.1.2343114615.000749210.0652734846.1.2310963020.001052919.0682917917.1.2267676825.001668720.0742292088.1.2253204323.001932692.0710710089.1.2252782354.0105250191.2114927788.007972194.12351152511.1.2072941880.007258942.10589198312.1.2037004224.008892185.11406220013.1.1849657836.020745415.16325923814.1.1678978737.036031833.21724645515.1.1359764487.073514715.34122793516.1.0696285850.177899360.68329900517.1.0193661970.3970542741.4088079618.1.0192417786.3931284801.3972888719.1.0187180868.3790873691.3614591320.1.0180956915.3717613231.3525710321.1.0160190997.3640753701.3850687422.1.0126064378.3751342921.5188111423.1.0059547114.4289360571.9034437224.1.0019056787.5007576152.3997357725.1.0011632693.5290739082.6347789226.1.0006871616.5469015662.8271744427.1.0003546795.5574224162.9926598528.1.0002842715.5604100253.0673789329.1.0002815003.5614781273.0876184630.1.0002814377.5618414173.0918701931.1.0002814332.5619615613.0929751732.1.0002814332.56196996