篩選與單克隆挑取

****G418篩選原理及方法分析轉(zhuǎn)化的功能和表達需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細胞染色體。外源基因進入細胞后，部分能夠通過細胞質(zhì)進入細系列非同源性分子間重組核連接，最終整合進細胞染色體。細胞基因組自由部分表達，所以整合并不一定意味著表達，只有整合到表達區(qū)的基因才會表達，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達的量也是不同的。由于攝取、整合、表達外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列(neo抗性基因)攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418對原核和真核等細胞都有毒性,包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞,也包括原生動物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達,使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G418的這一選擇特性,已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛應(yīng)用。G此，特性明確的細胞====================================================細胞系或機體中國倉鼠卵巢細胞盤基網(wǎng)柄菌屬母G418濃度(ug/ml)700~80010~35125~500====================================================由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以加藥時間不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽方法：()lGgml的完全培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)3個平行孔，三天一換液，繼續(xù)培細胞維持培養(yǎng)的濃度。6.確定最佳篩選濃度：在篩選10~14天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出a轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時或者更長，到細胞增長接近匯合時按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞密度增至50％~ 養(yǎng)，待其逐漸增大后；其它抗生素。4、由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，G加抗生素的時機：主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。6、體內(nèi)的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程，期間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細胞生長因子。這個過程也是細胞同化培養(yǎng)基的過程。細胞越多則其同化作用越強，所以細胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長。在篩選后期，大批細胞死亡，不換液沒有死亡的細胞就會受到死亡細胞的影響，換液后殘留的少量細胞對培養(yǎng)基的同化作用不強，也不利于生長?？字屑毎麛?shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要a培養(yǎng)同源細胞至半?yún)R合狀態(tài)時，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24~48小時后，吸出所有培養(yǎng)液的預(yù)試驗，效果就很好了。后面做正式的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以及單克隆篩選什么的都沒有問題，至今穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株還長得定要根據(jù)自己對該種細胞的熟悉程度，例如接種多大密度多長時間可以長滿等等來最終確定，每種細胞的性情都是不同。預(yù)試驗嘛，本身就是摸索。它抗生素。 GGG匯合度(confluence)也許是我們實驗室的翻譯，實際上就是指細胞占培養(yǎng)表面的比例，如果細胞鋪滿了整個容器，我們2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起(我的細胞簇離的很近)，c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀能夠被吸走為止。的培養(yǎng)液中加入小于96個的細胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意,我也百思不得其解,只好做多一點的96孔板來補充。培養(yǎng)SPC-A1(人肺癌細胞)，轉(zhuǎn)所幫助。lml第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會有某個孔中單個熒光細胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一96板，在里面隨便種一些細胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5~6次后非常熟練了。過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。方法4。我曾經(jīng)幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺內(nèi)紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有什么問題)，你可以試試，只要小心一些就行了。 2)轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個大皿(1：6)或者兩個大皿(1：12)。3)再過一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。4)依據(jù)細胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細胞就形成單克隆。ul塊24孔板上。le形成的細胞集落就少，而且真陽性也較少。對于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細胞，我會連續(xù)轉(zhuǎn)染三次(中間如果細胞長滿了就傳代)，好像比較有效。除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時也多。12、轉(zhuǎn)進去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細胞內(nèi)的？無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進細胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細胞系。且，同一細胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同，不同細胞同一基因的數(shù)目也不會相同，這點可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細胞內(nèi)隨機含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個比方，一個大口袋，抓100個紅球，再抓100個黃球，然后以從中抓若干個，這些球均為紅球的概率有多大呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個紅球，另一次抓著10個紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因為二者出現(xiàn)的概率比是恒定的。外源基因整合后的基因表達量與整合的位置高度相關(guān)，如果整合發(fā)生在活性轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)區(qū)，則有利于表達。通常用的載體是靠非同源重組隨機整合的，所以為了獲得高表達細胞株，需要對重組克隆進行篩選。某些載體如pcDNA3包含幾率。對普通的表達載體來說，即使抗性基因表達也無法保證外源基因的整合，表達載體隨機整合的結(jié)果常常導(dǎo)致目因有一定的聯(lián)鎖，并不是完全相互獨立的。只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達維持就是只要養(yǎng)這種細胞，就要維持?？梢栽俚托?，但不能沒有?；蛘吒粢欢〞r間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實際上我們在篩選耐藥株呀。拷貝整合的高表達的克??？ neo的產(chǎn)物是酶，過高的G418濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細胞也要被毒死的，而此時過多的酶要求會對細胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們曾試過，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細胞，在不同濃G嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解要看細胞生長情況和培養(yǎng)基的狀況，剛加藥時細胞死亡不多，很快培養(yǎng)基就會變酸變黃，要根據(jù)情況及時換液。篩選中期會有大批細胞死亡，要根據(jù)死亡細胞多少換液以去除死亡細胞。18、通過篩選后沒有死亡的細胞不能直接用嗎？一定要單克隆嗎？難道單克隆一次還不夠還要再來一次嗎？大多數(shù)凍存，留200cell左右就可以進行該操作了。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是19、篩選后的細胞和原來的細胞性狀差異很大這正常嗎？基本算正常，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞據(jù)細胞種類不同其形態(tài)都較正常細胞有變化，有的很明顯，比如說細胞變大，生長緩慢，方面防止細胞回復(fù)，因為你轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒對于細胞而言畢竟是個負(fù)擔(dān)，細胞較傾向于甩掉負(fù)擔(dān)輕裝前進，這一點對于腫瘤細胞尤甚；另一方面，如果插入的質(zhì)粒明顯和細胞周期有關(guān)的話，這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞傳不了幾代就會死亡。在傳G的細胞。也不一定.依據(jù)實驗?zāi)康呐c要求而定.如果克隆效率較低的細胞,套環(huán)可能更好.用96孔板法,如果不是每孔單個細胞,就不個板,100萬個細胞就需要100個板,對于轉(zhuǎn)基因細胞篩選或基因打靶,工作量就太大了.且細胞在單獨生長條件下,遠遠不如千萬個細胞共同培養(yǎng)活力好.因此還得看這位朋友使用的是什么細胞,有限細胞系還是無限細胞系,轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因,篩選還是不篩選,需要的單細胞克隆株數(shù)量多少?文獻后發(fā)現(xiàn)沒有一個定論的說法。即使對于同一種細胞其篩選劑量和篩選時間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講，定表達最好要一直篩選到細胞傳代后。不知這種觀點對不對。然而開始篩選的劑量、維持劑量以及篩選持續(xù)時間又該如何確定？維持劑量與開始篩選時的劑量是否有一定關(guān)系？部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400-800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。1)正式試驗前先要根據(jù)你的細胞做好預(yù)試驗細胞死亡這是很正常的現(xiàn)象，這些細胞都是所不需要的。2。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)對于同一種細胞其篩選劑量和篩選時間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講，如果穩(wěn)定表達最好要一直篩選到細胞傳代后。不知這種觀點對不對。然而開始篩選的劑量、維持劑量以及篩選持續(xù)時間又該如何確定？維持劑量與開始篩選 我應(yīng)該保持這個濃度多少天才能確保我篩選完成呢？在這期間可以換液嗎？篩選完了之后存活的細胞再培養(yǎng)傳代的話，培養(yǎng)基中是否還應(yīng)該加一定濃度的G418？如果要加的話什么濃度比較合適？液一次。篩選完了之后存活的細胞再培養(yǎng)傳代的話，培養(yǎng)基中應(yīng)該加一定濃度作步驟有問題嗎？看了你的操作步驟，個人觀點認(rèn)為你挑出來的不能稱之為單克隆，在6孔板里用G418篩選兩周后只是大部分細胞死克隆化的操作(具體操作方法見附件)。從嚴(yán)格意義上來講，單克隆化的操作一般要進行2-3次，經(jīng)此操作后長起來的才能稱之為單克隆。另外，在把克隆或單克隆放大的過程中動作一定要輕柔，否則很容易出現(xiàn)你所說的細胞不貼壁死凍存，以備后續(xù)試驗。25、我想問怎樣的方法可以把陽性克隆從培養(yǎng)瓶中取下來，書上說用彎頭吸管，我試了，不好用，根本就不能完整的如何挑選克隆。你可以按以下操作方法進行：(1)將已形成克隆的培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察克隆位置，并將各個克隆位置用標(biāo)記筆標(biāo)記準(zhǔn)確；(2)在超凈臺內(nèi)，棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液；(3)用鑷子夾取一塊濾紙塊，用0.25%Trypsin消化液浸濕，置于所標(biāo)記克隆位置處，5-20秒；(有人可提前在一孔中(4)將24孔培養(yǎng)板每孔加G418選擇培養(yǎng)基2ml，用鑷子取出已黏附克隆細胞的濾紙快，置于一個孔中的培養(yǎng)基中，步鑒定工作。****單克隆挑取為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除發(fā)結(jié)合有隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號筆做個標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或者用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。鑒定之后 一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機整合，會導(dǎo)致表達的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細胞克隆。具體方法：mm紙封口高壓滅菌.5.消化一定時間后(根據(jù)你消化該細胞所需時間),將濾紙片取出,立即轉(zhuǎn)移至事先加有培養(yǎng)液的6孔板中.6.擴大培養(yǎng)即可.的就是不要搖動平皿，那樣會使克隆不純。****轉(zhuǎn)染和篩選：1.使用含編碼抗生素抗性基因表達序列的質(zhì)粒(如pSV2neo)轉(zhuǎn)染細胞。定。含抗生素的培養(yǎng)基每周更換兩次。細胞。****單克隆化后細胞特點和處理：1.單克隆后細胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達對細胞的生長有一定的影響，查文獻確認(rèn)一下。2.單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時保證板子不影響細胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。因此做功能時要停藥培養(yǎng)合適時間后再做。PA317細胞后再此篩選(需要隔一段時間再加壓篩一次)，細胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用GG度培養(yǎng)一天看細胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。時你得到的細胞株可能失去了此啟動子,或者是改變了細胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對照鑒定一下!2.轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機的，一般兩月后(傳代10代以上)還表達你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)****進行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因(經(jīng)測序驗證)—準(zhǔn)備真核表達載體－將目的基因插入表達載體中－轉(zhuǎn)染－篩選－鑒定濾過除菌。 二、操