小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察

姓名 系年級 組別 同組者 科目細(xì)胞生物學(xué)實驗題目小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察學(xué)號 小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察一?實驗?zāi)康??了解快速制備動物染色體標(biāo)本的方法，掌握小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備方法。觀察小鼠睪丸染色體的數(shù)目及其形態(tài)特征。掌握小鼠睪丸染色體標(biāo)本制備基本過程，了解操作步驟的原理。二實驗原理（—）染色^體染色體是基因的載體。真核細(xì)胞染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)是重要的遺傳指標(biāo)之一。制備染色體標(biāo)本無疑是細(xì)胞學(xué)最基本的技術(shù)之一，優(yōu)良的染色體制片是進(jìn)行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。染色體的制備在原則上可以從所有發(fā)生有絲分裂的組織和細(xì)胞懸浮液中得到。最常用的途徑是從骨髓細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞和組織培養(yǎng)的細(xì)胞中制備染色體。本實驗采用的方法是從小鼠的睪丸細(xì)胞中獲取。染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞增殖周期中是不斷地運動變化的，一般在有絲分裂中期，染色體的形態(tài)最典型、最易辨認(rèn)和區(qū)分。因此，制備染色體標(biāo)本獲取的是中期細(xì)胞。染色體特征：數(shù)目（2n=?2?長度（絕對長度、相對長度）3.著絲粒位置（M/SM/ST/T）4?隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置5.帶型分析（二）操作方法小型動物的染色體制片最好最有效的材料就是骨髓組織（由于分裂活動旺盛,睪丸也可以）。利用睪丸細(xì)胞的制片技術(shù)雖然需要離心以及細(xì)致的操作，但其基本程序是簡便的。在小鼠睪丸中，細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂比較旺盛，因此不需要體外培養(yǎng)就可以直接得到分裂中期細(xì)胞。通過小鼠睪丸得到染色體比較簡便，一般不需要無菌操作。用秋水仙素作為有絲分裂的抑制劑。由于小鼠睪丸細(xì)胞分裂活動旺盛，具有高度的分裂能力，本實驗采用這一材料，通過前處理、低滲、固定、制片、染色等步驟制得染色體標(biāo)本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進(jìn)行染色體組型分析。減數(shù)分裂是細(xì)胞分裂染色體數(shù)目減半時發(fā)生在性細(xì)胞的形成過程中。哺乳動物在性成熟以后，精巢內(nèi)的性細(xì)胞總是在分批分期不斷的成熟，因此，對哺乳動物的精巢進(jìn)行一定的技術(shù)處理，隨時都可以獲得減數(shù)分裂過程中各個時期染色體的標(biāo)本。用適量的秋水仙素溶液注入動物腹腔內(nèi)，可以阻止分裂細(xì)胞紡錘絲的形成，姓名 系年級 組別 同組者 科目細(xì)胞生物學(xué)實驗題目小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察學(xué)號 從而積累大量處于分裂中期的細(xì)胞。利用上述原理，通過常規(guī)的制片方法，觀察小鼠睪丸細(xì)胞的染色體。（三）Giemsa染色法MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料組成。前者化學(xué)名為曙紅亞甲基藍(lán)II,對胞質(zhì)著色較好；后者對胞核著色較好。因此MGG染色，可兼兩者的優(yōu)點，常用于細(xì)胞涂片染色。染色結(jié)果：染色將細(xì)胞核染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)和核仁染成藍(lán)紫色。其優(yōu)點：染色方法簡單，且兼有瑞氏、姬氏兩種染色的優(yōu)點，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG染色對胞質(zhì)胞核染色效果均較好，結(jié)構(gòu)清晰，所染細(xì)胞亦比HE染色的細(xì)胞大；同時對細(xì)菌、霉菌及膽固醇結(jié)晶的顯示也很清楚。因此適用于淋巴造血系統(tǒng)的細(xì)胞標(biāo)本、胸腹水、穿刺標(biāo)本等。尤其對鑒別惡性淋巴瘤的類型，MGG染色更有幫助。實驗材料材料小白鼠。試劑秋水仙素、0.3%KCl、固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、0.9%的NaCl、Giemsa染液等。器材注射器、針頭、解剖盤、解剖剪、鑷子、玻璃吸管、10ml刻度的離心管、離心機、載玻片（冰片）、顯微鏡、銅網(wǎng)、擦鏡紙、小燒杯、吸水紙、天平等。實驗步驟實驗步驟：預(yù)處理f取睪丸f剪碎f離心f低滲f離心f固定f離心f固定f滴片f染色f觀察取雄性小鼠以每克體重4ug注射秋水仙素，經(jīng)14?16小時后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸用生理鹽水（0.9%的NaCl）洗去血污。放入裝有1ml0.3%KCl液的小燒杯中剪碎（呈乳白色）。用銅網(wǎng)過濾到刻度離心管中，再加0.3%KCl液至4ml。37°C靜置30min，進(jìn)行低滲處理。離心：800-1000r/min離心8min,棄上清。加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定8min。7?再以800-1000r/min離心8min。8.棄去上清液，加1ml固定液，制成細(xì)胞懸液固定5min。9?取潔凈的低溫預(yù)冷載片，距載片10?15cm高度滴下2?3滴細(xì)胞懸液，從載片一邊向另一邊輕輕吹氣，并同時輕輕敲打載片，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體展開。10?用濾紙擦去載片上多余液體，在背面做上標(biāo)記，空氣干燥。11.用Giemsa染色20-30min（采用倒置染色法，目的在于可使載玻片充分接觸姓名 系年級 組別 同組者 科目細(xì)胞生物學(xué)實驗題目小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察學(xué)號 染液，若有雜質(zhì)也可沉降至底部，不會和玻片直接接觸），細(xì)水沖洗玻片背面，去多余染液，氣干。11.鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。實驗結(jié)果1?實驗結(jié)果如下圖所示圖1小鼠睪丸細(xì)胞中期染色體觀察圖（10X40）圖2小鼠睪丸細(xì)胞中期染色體觀察圖放大圖（10X40）由圖2,能看到清晰的分裂中期的染色體，清楚地看到著絲點。可以大致數(shù)出染色體的數(shù)目為32條。視野中還有許多細(xì)胞的染色體沒有完全展開，或者沒有破裂，可能原因有：滴片時的高度過低，導(dǎo)致細(xì)胞沒有破裂，或者是低滲處理沒處理好，染色體沒充分展開。六?思考與討論1.注意事項⑴用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期，使中期染色體停留在赤道面處。姓名 系年級 組別 同組者 科目細(xì)胞生物學(xué)實驗題目小鼠睪丸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察學(xué)號 ⑵用低滲法使將細(xì)胞膨脹，以至于在滴片時細(xì)胞被脹破，使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上，低滲與離心等步驟的操作要輕。⑶空氣干燥法可使使細(xì)胞的染色體在載片上展平，經(jīng)Giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象。⑷細(xì)胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。⑸染色體形態(tài)和分布良好，最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辯認(rèn)，以免差錯。⑹所觀察的細(xì)胞處于同一有絲分裂階段（分裂中期），即染色體螺旋化程度或染色體長短大致一樣，在所觀察的細(xì)胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響觀察和計數(shù)。⑺固定液和Giemsa染液須現(xiàn)配現(xiàn)用。⑻低滲時間應(yīng)掌握準(zhǔn)確。⑼低滲后的細(xì)胞吹打時動作要輕，離心速度不能高于1000r/min。實驗結(jié)果分析本實驗可能至少有以下幾點導(dǎo)致實驗失敗或影響實驗觀察：⑴取睪丸時用生理鹽水沖洗睪丸時未沖洗干凈，導(dǎo)致血污仍然存在，影響實驗結(jié)果觀察。⑵剪碎時組織塊仍比較大，分離出的單個細(xì)胞仍較少。⑶低滲時因時間過長或試劑濃度過低導(dǎo)致細(xì)胞吸水漲破。⑷離心時因時間過長或轉(zhuǎn)速過快導(dǎo)致細(xì)胞破裂，或因時間不夠、轉(zhuǎn)速過低而未達(dá)到預(yù)期目的。⑸固定時加液的量不合適或時間過長。⑹滴片時未將細(xì)胞震碎，吹氣和敲打時未使細(xì)胞均勻散開，影響實驗觀察。⑺染色不充分或不均勻。實驗