熒光定量技術(shù)在臨床的應(yīng)用

熒光定量技術(shù)在臨床的應(yīng)用第一頁，共五十一頁，2022年，8月28日內(nèi)容提要一、基因診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位二、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用三、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的主要問題第二頁，共五十一頁，2022年，8月28日基因診斷的物質(zhì)基礎(chǔ)及與其它

診斷方法的區(qū)別基因診斷免疫學(xué)診斷臨床診斷細(xì)胞膜細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄

mRNA翻譯蛋白質(zhì)臨床表現(xiàn)生化診斷第三頁，共五十一頁，2022年，8月28日臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展

三個(gè)時(shí)代標(biāo)志技術(shù)性質(zhì)生化診斷時(shí)代生化分析表象免疫學(xué)診斷時(shí)代酶免、放免表象分子(基因)診斷時(shí)代基因體外擴(kuò)增(PCR)本質(zhì)第四頁，共五十一頁，2022年，8月28日1、病原體的定量檢測及藥物療效考評(píng)（HBV）2、腫瘤基因和腫瘤標(biāo)志物表達(dá)(mRNA)的檢測（P53）3、遺傳病基因的檢測（地中海貧血）4、與疾病相關(guān)的各種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的定量檢測6、建立病原體的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第五頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR在病原體檢測中的應(yīng)用一、肝炎病毒定量檢測二、性病病原體檢測三、優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)項(xiàng)目檢測四、結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測五、其他病原體檢測第六頁，共五十一頁，2022年，8月28日病毒性肝炎概況病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)橹鞯囊唤M傳染病。按病毒的生物學(xué)特征、臨床和流行病學(xué)特征，1989年在日本東京的國際肝炎學(xué)術(shù)討論會(huì)上，將其分為甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后還報(bào)道了己（F）型和庚（G）型。我國是個(gè)肝炎大國，病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達(dá)1.2億，每年新增加的感染者也在百萬以上，丙肝發(fā)病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷延，如得不到及時(shí)的治療，部分將會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。第七頁，共五十一頁，2022年，8月28日HBV基因型與血清型關(guān)系及流行病學(xué)分布基因型血清學(xué)亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Badw2ayw1321550％（常）T185816％東南亞、中國、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）東南亞、中國、日本、澳洲、美國第八頁，共五十一頁，2022年，8月28日病原學(xué)乙型肝炎檢測標(biāo)志物HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA第九頁，共五十一頁，2022年，8月28日乙型肝炎免疫檢測和PCR結(jié)果異同“大三陽”PCR結(jié)果陰性抗-HBs陽性，PCR結(jié)果陽性第十頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)對(duì)性傳播疾病的檢測一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原體、解脲脲原體（CT、UU）(有證）三、梅毒螺旋體（TP）四、單純庖疹病毒（HSV）五、乳頭瘤病毒（HPV）（有證）六、人類免疫缺陷病毒（HIV）第十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)對(duì)性傳播疾病檢測的注意事項(xiàng)1標(biāo)本的選取

TP

HSV

2臨床療效考評(píng)第十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日超高倍第十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR診斷TORCH綜合征傳統(tǒng)的TORCH病原體：TOX,other,RV,CMV,HSV新近發(fā)現(xiàn)的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘—帶狀庖疹V、腸道V、乙肝V、丙肝V、

HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、人微小病毒B19等第十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日TORCH感染的實(shí)驗(yàn)室診斷一、組織培養(yǎng)：慢，費(fèi)力，陽性率低二、血清學(xué)診斷：

IgG：IgM：

1、不能定量分析

2、抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響

3、產(chǎn)生假陽性三、基因診斷方法

原理：檢測TORCH病原體的核酸優(yōu)點(diǎn)：1、客觀指標(biāo)2、敏感性、特異性高3、定量指標(biāo)熒光定量PCR在TORCH診斷中的應(yīng)用：

1、篩選TORCH的患者

2、建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)第十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)檢測TOX孕婦TOX感染的危害孕早期（<3月）25%感染胎兒，后期65%感染胎兒但早期感染危害嚴(yán)重易感人群

1、吃生或未熟的含有囊蟲或囊蟲卵的肉類

2、從事動(dòng)物尸體、皮毛等工作孕婦

3、飼養(yǎng)寵物，如貓、狗者第十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)檢測HCMV人群自然感染率達(dá)到60—80%，可通過胎盤、產(chǎn)道、母乳傳染初次感染HCMV的孕婦傳染胎兒的危險(xiǎn)性15——50%再次感染僅為0.5%—2.5%第十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日注意事項(xiàng)缺乏分子診斷標(biāo)準(zhǔn)輔助指標(biāo)第十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)檢測21三體綜合征

孕婦外周血中有胎兒的少量細(xì)胞通過PCR技術(shù)檢測孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞第十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)用于性別鑒定

熒光定量PCR檢測SRY基因

SRY基因，雄性的性別決定基因，指Y染色體上具體決定生物雄性性別的基因片段

科研應(yīng)用不提供商業(yè)試劑第二十頁，共五十一頁，2022年，8月28日EB病毒載量與鼻咽癌

血漿EBV載量與鼻咽癌顯著相關(guān)鼻咽癌病人血漿EBV與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)

10個(gè)復(fù)發(fā)病人：32，250copies/ml15個(gè)二年持續(xù)緩解病人：0copies/ml17個(gè)隨訪病人：臨床惡化前6月顯著升高

第二十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)用于肺部感染的診斷一、肺炎支原體的檢測二、結(jié)核桿菌的檢測意義：1、快速診斷

2、治療方案與細(xì)菌感染的治療方案不同第二十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日地中海貧血海洋性貧血又稱地中海貧血（Thalassemia）。是一組遺傳性溶血性貧血。其共同特點(diǎn)是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成。導(dǎo)致血紅蛋白的組成成分改變，本組疾病的臨床癥狀輕重不一，大多表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性溶血性貧血

本病以地中海沿岸國家和東南亞各國多見，我國長江以南各省均有報(bào)道，以廣東、廣西、海南、四川、重慶等省區(qū)發(fā)病率較高，在北方較為少見第二十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日病因和發(fā)病機(jī)制本病是由于珠蛋白基因的缺失或點(diǎn)突變所致。組成珠蛋白的肽鏈有4種，即α、β、γ、δ鏈α地中海貧血

大多數(shù)α地中海貧血是由于α珠蛋白基因的缺失所致β地中海貧血

β地中海貧血的發(fā)生主要是由于基因的點(diǎn)突變

第二十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日白血病白血病是一類常見的造血系統(tǒng)惡性疾病。特點(diǎn)為白細(xì)胞及其前身幼稚細(xì)胞在骨髓或其他造血組織中彌漫性地異常增生，進(jìn)而浸潤人體組織器官，產(chǎn)生各種癥狀急性白血病的分型1.急性非淋巴細(xì)胞白血病M1（急性粒細(xì)胞白血病未分化型）M2（急性粒細(xì)胞白血病部分分化型）M3（急性早幼粒細(xì)胞白血病）M4（急性粒一單核細(xì)胞白血?。㎝4Eo（伴嗜酸性粒細(xì)胞增多的粒一單核細(xì)胞白血?。㎝5（急性單核細(xì)胞白血?。㎝6（急性紅白細(xì)胞）M7（急性巨核細(xì)胞性白血病）2.急性淋巴細(xì)胞白血病共分3型。L1L2L3慢性白血病的分型慢性髓系白血病慢性髓細(xì)胞白血病慢性嗜中性粒細(xì)胞白血病慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病2.慢性淋巴細(xì)胞白血病

第二十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日融合基因（1）BCR/ABL-P210，BCR/ABL-P190（2）PML/

RARa-L，PML/

RARa-S

（3）ETO/AML（4）MLL/AF4（5）TEL/AML1（6）PBX1/EA2

（7）CBFB-MYH11

（8）HOX-11L2

（9）SIL-TAL1急性淋巴細(xì)胞性白血病

TEL/AML1急性粒細(xì)胞白血病

ETO/AML急性早幼粒細(xì)胞白血病PML-RARa慢性粒細(xì)胞白血病

BCR-ABL

第二十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日TBP內(nèi)參內(nèi)參即是內(nèi)部參照可簡便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正第二十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日臨床PCR檢驗(yàn)注意的問題臨床PCR檢驗(yàn)標(biāo)本的處理、保存及核酸提取方法第二十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日標(biāo)本采集標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)采樣及運(yùn)輸容器標(biāo)本采集中的防污染

第二十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日臨床標(biāo)本的處理和保存血清（漿）全血外周血單個(gè)核細(xì)胞痰棉拭子膿液體液乳汁組織第三十頁，共五十一頁，2022年，8月28日血清（漿）DNA測定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對(duì)測定影響不大RNA測定，標(biāo)本的獲取和保存方式對(duì)測定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時(shí)內(nèi))分離血清，標(biāo)本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，較長期保存應(yīng)在-70℃下

第三十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日全血以全血作為待測標(biāo)本時(shí),必須注意抗凝劑的選擇,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素全血樣本如用于DNA提取檢測,可4℃下短期保存,如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA第三十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日外周血單個(gè)核細(xì)胞

外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液,裂解全血中的紅細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌,即可得到單個(gè)核細(xì)胞外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不提取核酸,可保存于-70℃下第三十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日痰痰屬于分泌物,臨床上常用作為結(jié)核桿菌DNA測定標(biāo)本痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時(shí),需對(duì)樣本進(jìn)行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下第三十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日棉拭子在使用PCR方法檢測性病病原體時(shí),臨床標(biāo)本一般為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置5～10分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清立即離心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,則需保存于-70℃下.第三十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日膿液膿液的處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測定的標(biāo)本,粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗2～3次后,即可用于DNA提取對(duì)于用于非分枝桿菌測定的膿液標(biāo)本,如過于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清立即離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70℃第三十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日體液臨床體液標(biāo)本包括胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本的保存同上。第三十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日乳汁

乳汁有時(shí)也可作為標(biāo)本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測。提取方法：乳汁標(biāo)本置4℃冰箱過夜→取100ul中清液→10000rpm/min離心10分鐘→盡可能去除奶酪（建議用棉簽蘸去）→棄上清加50ulDNA提取液→沸水浴10分鐘→10000rpm/min離心5分鐘→取5ul上清點(diǎn)樣擴(kuò)增。第三十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日組織

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保存于50%乙醇中,具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,加入適量的生理鹽水,然后,邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%.這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日,4℃可保存6年。石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取第三十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日臨床標(biāo)本中PCR反應(yīng)抑制物內(nèi)源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。

外源性的:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。第四十頁，共五十一頁，2022年，8月28日常見的核酸提取方法煮沸法柱提取磁珠法一步法二步法裂解方法煮沸煮沸化學(xué)裂解化學(xué)裂解分離方法離心離心親和吸附吸附或雜交步驟煮沸裂解離心，去除大分子的抑制物取上清擴(kuò)增煮沸裂解離心棄上清，濃縮標(biāo)本并去除小分子抑制物離心，取上清擴(kuò)增，去除大分子抑制物?；瘜W(xué)裂解過柱吸附洗滌洗脫取洗脫液擴(kuò)增化學(xué)裂解加磁珠吸附洗滌洗脫取洗脫液擴(kuò)增抗干擾能力差較差好最好提取物組分較小分子量的混合物與核酸相似分子量的混合物全核酸特定病原的核酸自動(dòng)化程度手工手工手工或自動(dòng)半自動(dòng)或全自動(dòng)第四十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日第四十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日RNA提取的獨(dú)特性臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對(duì)RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。如何避免RNase對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase對(duì)提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在。第四十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日

RNA提取所用器皿的處理經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA。

實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時(shí)以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。第四十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備

對(duì)于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘。須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液。第四十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日RNA提取中RNase污染的控制實(shí)驗(yàn)操作人員的頭發(fā)、唾液、手是RNase污染最主要的潛在來源。策略是：

在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過程中,都應(yīng)戴一次性帽子、口罩和手套。

在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。第四十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日熒光定量PCR技術(shù)檢測的報(bào)告形式定量測定結(jié)果報(bào)告：根據(jù)所使用的測定方法的測定范圍報(bào)告結(jié)果，如樣本測定結(jié)果高出此范圍，則可報(bào)告>多少，也可對(duì)樣本稀釋后再檢測；如低于此范圍，則報(bào)告<多少，如<103拷貝數(shù)/ml，而不能報(bào)告為0拷貝數(shù)/ml或陰性。拷貝數(shù)與病原體的關(guān)系：拷貝數(shù)與病原體的數(shù)量成正相關(guān)。一般來說細(xì)菌是多拷貝的，病毒是單拷貝的。DNA拷貝數(shù)單位和質(zhì)量單位：100拷貝HBV＝0.04fg國際單位IU第四十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日拷貝數(shù)/ml的確定：DNA/RNA參考品（質(zhì)粒等）測量OD260的值得到mg/ml通過與分子量的計(jì)算，得到拷貝數(shù)