工業(yè)發(fā)酵菌種選育

其次章工業(yè)發(fā)酵菌種選育第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種工業(yè)常用的生產(chǎn)菌種微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的要求工業(yè)發(fā)酵菌種的來(lái)源現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)一工業(yè)常用的生產(chǎn)菌種細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，

藻類、病毒等也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)1、細(xì)菌

枯草芽孢桿菌乳酸桿菌醋酸桿菌棒狀桿菌短桿菌淀粉酶蛋白酶乳酸氨基酸肌苷酸

用于生產(chǎn)：現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)1、細(xì)菌

現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)1、細(xì)菌

現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)2、放線菌常用的放線菌：

鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。它的最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生素。

如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)3、酵母菌釀酒面包低凝固點(diǎn)石油脂肪酶酵母菌體蛋白生產(chǎn)應(yīng)用

工業(yè)上用的酵母菌啤酒酵母假絲酵母類酵母現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)藻狀菌綱根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱紅曲霉半知菌類曲霉、青霉4、霉菌產(chǎn)品酶制劑抗生素有機(jī)酸甾體激素等現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)5、其他生物：A:擔(dān)子菌B：藻類藻類工廠現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)二微生物的代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝關(guān)系產(chǎn)生初級(jí)代謝產(chǎn)物，后產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝是次級(jí)代謝的基礎(chǔ)次級(jí)代謝是初級(jí)代謝在特定前提下的接著與發(fā)展現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)1、初級(jí)代謝產(chǎn)物是指微生物通過代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的、

自身生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，

如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。初級(jí)代謝作用

能使養(yǎng)分物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)物質(zhì)與具生理活性物質(zhì)

為生長(zhǎng)供應(yīng)能量。嚴(yán)格受代謝調(diào)控限制?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)2、次級(jí)代謝產(chǎn)物通過次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物

依據(jù)其作用,可將其分為抗生素,激素,生物堿,毒素等類型.以初級(jí)代謝產(chǎn)物為原料進(jìn)行合成。合成受環(huán)境影響大，對(duì)自身無(wú)明確生理作用。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)3、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物外源物質(zhì)加入培育基后，在微生物代謝過程結(jié)構(gòu)發(fā)生了化學(xué)變更所得的產(chǎn)物。降解木質(zhì)素類真菌和能降解多環(huán)芳香烴類的球紅假單胞菌作為煤炭轉(zhuǎn)化用的微生物，現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)三發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的要求

微生物的特性工業(yè)化菌種的要求志向的生產(chǎn)菌種利用微生物的特點(diǎn)：

(1)對(duì)四周環(huán)境有極大的適應(yīng)實(shí)力(2)有極強(qiáng)的消化實(shí)力(3)有極強(qiáng)的繁殖實(shí)力現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)

有些微生物能在厭氧的條件下生長(zhǎng)有些微生物能夠利用簡(jiǎn)潔的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物滿足自身的生長(zhǎng)有些微生物能進(jìn)行困難的代謝有些微生物能利用較困難的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長(zhǎng)1、微生物的特性現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)

能夠利用廉價(jià)的原料，大量高效地合成產(chǎn)物有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡(jiǎn)潔

遺傳性能相對(duì)穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性低

生產(chǎn)特性要符合工藝要求2、工業(yè)化菌種的要求現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)生長(zhǎng)繁殖快速；產(chǎn)量高；易培育；發(fā)酵周期短；耐噬菌體；純種。3、志向的生產(chǎn)菌種現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)四工業(yè)發(fā)酵菌種的來(lái)源

從自然界中分別對(duì)野生菌株進(jìn)行人工誘變運(yùn)用重組DNA技術(shù)改造菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得從正突變的生產(chǎn)菌中獲得現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)其次節(jié)生產(chǎn)菌種的選育目前育種總趨勢(shì)菌種選育的主要目的菌種選育的重要指標(biāo)常用的菌種選育方法現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)一、目前育種總趨勢(shì)

從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌自然選育轉(zhuǎn)向代謝育種從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)二、菌種選育的主要目的提高產(chǎn)量改進(jìn)質(zhì)量增加新品種改善工藝條件現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)原始產(chǎn)生菌實(shí)例青霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)黃色色素土霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)大量泡沫紅霉素產(chǎn)生菌不耐噬菌體不再分泌黃色色素泡沫削減耐噬菌體工業(yè)生產(chǎn)菌現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)三、菌種選育的重要指標(biāo)：菌種的養(yǎng)分特征菌種的生長(zhǎng)溫度菌種的適應(yīng)性菌種的穩(wěn)定性產(chǎn)物的得率和產(chǎn)物的濃度產(chǎn)物回收難易現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)四、常用的菌種選育方法自然選育誘變育種雜交育種基因工程育種現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)常用的名詞自發(fā)突變和誘發(fā)突變突變率正向變異（有益于生產(chǎn)的變異）負(fù)向變異（不利于生產(chǎn)的變異）衰退（菌種發(fā)生了負(fù)向變異）復(fù)壯（使衰退的菌種復(fù)原原有的優(yōu)良性能）現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)

1、自然選育定義目的特點(diǎn)操作步驟現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)

1）定義指利用微生物在確定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變，通過分別、篩選解除衰變型菌落，從中選擇正向變異菌株的過程。例如：從污染噬菌體的發(fā)酵液中

有可能分別到抗噬菌體的新菌株。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)從自然界篩選現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)顯著減毒的結(jié)核桿菌

（卡介苗）Descriptionofthecompany’sproducts定向培育230代13年自然育種的成功實(shí)例

1923年獲得卡介苗(BCGvaccine)牛型結(jié)核桿菌現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)2）目的純化復(fù)壯穩(wěn)定生產(chǎn)現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)3）特點(diǎn)自發(fā)突變率低，變異程度較略微，變異過程特殊緩慢（突變率10－9～10－6）自發(fā)突變不定向，負(fù)向變異可能性大，正向變異可能性小現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)4）操作步驟確定采樣環(huán)境

采樣

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案充分查閱資料增殖培養(yǎng)

確定增殖條件純種分離劃線、稀釋與組織分離

菌種篩選

純種鑒定、生產(chǎn)能力考查毒性試驗(yàn)其他鑒定現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)采樣采樣對(duì)象采樣季節(jié)采樣方式現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)采樣對(duì)象—土壤細(xì)菌和放線菌一般園田土和耕作過的沼澤土酵母和霉菌

富含碳水化合物的土壤和沼澤地中,如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)采樣的對(duì)象也可以是植物、腐敗物品、某些水域等。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)采樣季節(jié)以溫度適中，雨量不多的初秋為好采樣方式選點(diǎn)—在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)，用小鏟子除去表土取土—取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中扎好。標(biāo)記—記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，分別—將樣品逐步分批寄回，剛好分別?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)增殖培育通過選擇培育基來(lái)限制例如碳源利用的限制可選定糖、淀粉、纖維素或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)純種分別通過增殖培育，微生物還處于混雜生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)一步應(yīng)用選擇性限制條件分別純種分別的方法有稀釋分別法、劃線分別法等現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)稀釋分別法現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)平皿劃線分別法b.連續(xù)劃線分別法a.分區(qū)劃線分別法現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)從產(chǎn)物角度動(dòng)身依據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)有目的地設(shè)計(jì)培育基來(lái)篩選菌種從形態(tài)角度動(dòng)身依據(jù)菌落的外觀形態(tài)反映的微生物重要表征篩選。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐嘤仙L(zhǎng)，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別。菌種篩選（初篩+復(fù)篩）（1）平板篩選（初篩）現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)從生產(chǎn)性能考察小型發(fā)酵試驗(yàn)（搖瓶試驗(yàn)）考察發(fā)酵菌的生產(chǎn)性能，摸索最優(yōu)的發(fā)酵菌種。菌種篩選（2）搖瓶篩選

（初篩+復(fù)篩）現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)篩選原理變色圈法透亮圈法生長(zhǎng)圈法抑菌圈法菌種篩選現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)瓊脂培育基測(cè)試菌苔含藥物濾紙

抑菌圈抑菌圈法現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)自然界自然微生物可能產(chǎn)生毒素?fù)?jù)規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。其他鑒定—毒性試驗(yàn)現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)2、誘變育種AddyourtitleinhereAddyourtitleinhere誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選。包含誘變與篩選兩個(gè)部分。誘變以誘變劑處理樣品，造成大量死亡時(shí)使存活個(gè)體的突變率大幅提高。篩選淘汰負(fù)突變株，選出正突變株?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)青霉素生產(chǎn)菌株的誘變育種1943年，產(chǎn)黃青霉每毫升發(fā)酵液只產(chǎn)生約20單位的青霉素，通過透變育種和其它措施協(xié)作，目前的發(fā)酵單位已達(dá)到每毫升5萬(wàn)～10萬(wàn)單位。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)（1）誘變育種的步驟TextinhereTextinhereTextinhereTextinhere出發(fā)菌株的選擇（制定篩選目標(biāo)）突變的誘發(fā)（誘變劑的選擇）突變株的篩選現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)動(dòng)身菌株—指用于誘變的原始菌種來(lái)源從自然界分離生產(chǎn)菌種菌種保藏機(jī)構(gòu)動(dòng)身菌株的選擇性狀要求純種對(duì)誘變劑敏感生長(zhǎng)快營(yíng)養(yǎng)要求粗放發(fā)育早，產(chǎn)孢子多能積累少量產(chǎn)品或前體物篩選目標(biāo)高產(chǎn)副產(chǎn)品及有害產(chǎn)物少改良工藝現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)處理菌懸液的制備關(guān)鍵—制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)、活力類似的菌懸液誘變霉菌或放線菌時(shí)，應(yīng)處理孢子；對(duì)芽孢桿菌則應(yīng)處理芽孢要得到勻整分散的細(xì)胞懸液，可用無(wú)菌的玻璃珠來(lái)打散成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過濾菌懸液溶度：真菌、酵母（106—107個(gè)/ml）；

細(xì)菌（108個(gè)/ml），一般用生理鹽水或0.1M的磷酸緩沖液稀釋。動(dòng)身菌株的選擇現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)誘變處理方法誘變劑—能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)誘變劑的種類突變的誘發(fā)（誘變劑的選擇）誘變劑的選擇劑量現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)噬菌體物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑紫外線、X-射線，γ－射線堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑A誘變劑的種類現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)誘變劑協(xié)同效應(yīng)菌種單獨(dú)處理復(fù)合處理誘變劑突變率(%)誘變劑突變率(%)土曲霉紫外線X射線21.319.7紫外線+X射線42.8土曲霉氮芥(0.1%)紫外線不明顯4.7紫外線+氮芥11.0鏈霉菌紫外線γ射線31.035.0紫外線+γ射線43.6現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模的篩選：用死亡率90～99.9％的高劑量；小規(guī)模的篩選：常用死亡率70～90％的低劑量；偶用死亡率40～60％的更低劑量。B誘變劑的劑量誘變劑劑量相關(guān)因素物理：射線強(qiáng)度和處理時(shí)間化學(xué)：誘變劑溶度和處理時(shí)間一般選擇死亡率為70%-80%的劑量?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)C常用的誘變處理方法制備菌懸液→紫外照射→后培育與稀釋涂布混合藥品與菌液→保溫10~20min后終止反應(yīng)→后培育與稀釋涂布物理法——紫外誘變化學(xué)法——亞硝酸誘變現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)隨機(jī)篩選搖瓶篩選平板篩選理性化篩選依據(jù)微生物的代謝產(chǎn)物篩選突變株的篩選現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)理性化篩選舉例養(yǎng)分缺陷型—因突變而丟失合成某種物質(zhì)的實(shí)力，因此必需在培育基中添加某種物質(zhì)

才能生長(zhǎng)的突變類型。若某抗生素產(chǎn)生菌的初級(jí)代謝與次級(jí)代謝處于同一分支合成途徑，則篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物的養(yǎng)分缺陷型?？墒瓜鄳?yīng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物增產(chǎn)。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)（課本12頁(yè)圖2-1）芳香族氨基酸與氯霉素有共同的中間代謝產(chǎn)物：莽草酸；養(yǎng)分缺陷型細(xì)菌合成不了芳香族氨基酸，則莽草酸就會(huì)生成大量氯霉素。例一現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)例二賴氨酸發(fā)酵

（高絲氨酸缺陷型谷氨酸棒桿菌）

現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)雜交育種將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，再?gòu)闹蟹謩e和篩選出具有新性狀的菌株。為定向育種主要包括雜交和原生質(zhì)體融合兩種方法。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)雜交兩個(gè)性狀不同的菌株或變種之間進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合，遺傳物質(zhì)交換重新組合成新的性狀。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)細(xì)菌雜交于1946年在大腸桿菌K-12菌株中發(fā)覺并證明的養(yǎng)分缺陷型（A—）+養(yǎng)分缺陷型(B—)混合試驗(yàn)現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)原生質(zhì)體融合通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程，又稱細(xì)胞融合。

現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)基因工程育種把兩個(gè)不同性狀個(gè)體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起,經(jīng)過遺傳物質(zhì)分子重新組合,轉(zhuǎn)入一個(gè)受體細(xì)胞，形成新遺傳型個(gè)體的方式。在分子水平上的雜交

一般的雜交,在細(xì)胞水平進(jìn)行優(yōu)點(diǎn)：

目的性；方向性；高效率。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)菌種保藏的目的與原理菌種保藏的方法菌種保藏的注意事項(xiàng)菌種保藏的機(jī)構(gòu)第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)一、菌種保藏的目的與原理目的保持菌種存活率減少菌種變異，保持優(yōu)良性狀不染雜菌。原理根據(jù)菌種特性，創(chuàng)造有利于其休眠的環(huán)境（如干燥、低溫、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、加保護(hù)劑等）保存孢子、芽孢等的休眠體?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)二菌種保藏的方法斜面低溫保藏法液體石蠟封存保藏法砂土管保藏法懸液保藏法真空冷凍干燥保藏法低溫保藏法液氮超低溫保藏法現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)1、斜面低溫保藏法原理：低溫抑制；方法：把斜面菌種等放入4℃冰箱保藏；保藏時(shí)間：一般不超過3個(gè)月缺點(diǎn)：傳代次數(shù)多，易變異，易污染；改進(jìn)：接受密封性能較好的螺旋口試管替代傳統(tǒng)的棉塞；削減碳水化合物含量現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)2、液體石蠟封存保藏法

原理：隔絕空氣；方法：在培育好的菌種斜面上加入無(wú)菌石蠟油,高出斜面1cm,蠟封管口,直立，4℃冰箱保存；保藏時(shí)間：1～2年。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)3、砂土管保藏法適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細(xì)菌原理：人工模擬自然環(huán)境，將微生物吸附在載體上，干燥后保藏；方法：將砂與土以確定比例混合，裝入小試管滅菌，接種，抽真空干燥低溫保藏；保藏時(shí)間：1～10年?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)4、懸液保藏法適用于絲狀真菌、酵母型真菌及細(xì)菌中的腸道菌?；驹恚簩⑽⑸飸腋∮诓缓B(yǎng)分的溶液如蒸餾水、0.25M磷酸緩沖液（Ph6.5）或生理鹽水中寡養(yǎng)分保藏。保藏時(shí)間：約1年。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)5、真空冷凍干燥保藏法原理：低溫、干燥、缺氧；方法：制備菌懸液，與疼惜劑混合，置于安瓿管，低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，再抽真空使水分升華，密封，低溫保存；保藏時(shí)間：5～10年。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)6、低溫保藏法原理：－20℃低溫菌體代謝緩慢；方法：制備菌懸液1-2ml入密封性能較好的螺旋口試管－20℃保藏保藏時(shí)間：1～10年?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)7、液氮超低溫保藏法原理：超低溫，菌體新陳代謝停止；方法：將菌種加入滅菌后的10%甘油或5%二甲基亞砜（DMSO）疼惜劑中，密封于安瓿管，先降至0℃，再緩慢降至－35℃，再置于液氮罐保存；保藏時(shí)間：永久?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)ATCC應(yīng)用的菌種保藏法冷凍干燥保藏法和液氮保藏法可達(dá)到最大限度地削減傳代次數(shù)和避開菌種衰退保藏程序：先將原種制成若干液氮保藏管保藏,再制一批冷凍干燥保藏菌種作分發(fā)用。經(jīng)5年后,假定第1代(原種)的冷凍干燥保藏菌種已分發(fā)完畢,就再打開一瓶液氮保藏原種至少在20年內(nèi),凡獲得該菌種的用戶,至多只是