乙型肝炎病毒顆粒超離純化

乙型肝炎病毒顆粒超離純化第一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日常用離心機(jī)簡(jiǎn)介

BECKMANHITACHISORVALLHEREUSEPPENDORF第二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日低速離心:6,000rpm以下第三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日高速離心:25,000rpm以下第四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日超速離心:30,000rpm以上第五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日1.離心力2.相對(duì)離心力(RCF)3.沉降速度4.沉降系數(shù)(S)5.沉降時(shí)間和沉清因子(K)離心場(chǎng)中的基本物理概念第九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日離心力

F=ma=mω2r

ω:角速度(弧度rad/秒)ω=(2π×RPM)/60r:離心半徑第十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日相對(duì)離心力(RCF)

同一顆粒在離心時(shí)同地球的重力相比較后得到的值

RCF=離心力/重力=mω2r/mg=ω2r/g=1.12r(RPM/1000)2第十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日沉降速度V在離心力場(chǎng)的作用下,單位時(shí)間內(nèi)沉淀物運(yùn)動(dòng)的距離V=d2(ρp-ρm)ω2r18μ(f/f0)V大小與顆粒直徑(d2)成正比V與顆粒密度同介質(zhì)密度差(ρp-ρm)

成正比V與外加離心場(chǎng)(ω2r)成正比當(dāng)顆粒密度等于介質(zhì)密度時(shí),沉降速度接近于零V與介質(zhì)粘滯度μ成反比,粘滯度增加速度減慢V與顆粒形狀有關(guān).顆粒偏離球形越大f/f0的摩擦比也越大,速度越慢第十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日沉降系數(shù)(S)Svedberg

定義:單位離心力作用下的沉降速度物理意義:被測(cè)顆粒達(dá)到極限速度時(shí)所需要的時(shí)間.單位為秒.1S單位=10-13seconds

沉降系數(shù)與物質(zhì)的質(zhì)量、形狀、密度等因素有關(guān),也受溫度,水化密度,pH的影響,在實(shí)際工作中通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定.

蛋白質(zhì)：1-100S核酸：10-1000S

病毒：100-1000S細(xì)胞核：106-107S

完整細(xì)胞：107-108S原核核糖體70S(30S,50S)

第十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日沉清因子k和沉降時(shí)間tK因子主要由轉(zhuǎn)子決定。離心時(shí)，影響所需的沉降時(shí)間。離心分離某一物質(zhì)所需的離心時(shí)間t=K/S試管中，分離所需的時(shí)間與距離成正比。K因子小，分離所需的時(shí)間更短。K因子還受轉(zhuǎn)速影響，轉(zhuǎn)速高，時(shí)間短。第十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日各種離心方法沉降速度法

差速離心法速度區(qū)帶離心法

特點(diǎn):主要按顆粒大小,形狀不同分離沉降平衡法

密度梯度離心法（預(yù)制梯度，自成梯度）

特點(diǎn):以顆粒的密度差分離,與大小、形狀無(wú)關(guān)第十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日差速離心法原理：通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力的辦法，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的不同大小、形狀的顆粒分步沉淀。第十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日溶解的細(xì)胞（組織勻漿液）

600g離心10min

沉淀（細(xì)胞核）上清液（含細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體核糖體、可溶性蛋白）

10000g離心10min

沉淀上清液（細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體）（核糖體、可溶性蛋白）

100000g離心3h

沉淀上清液（核糖體）（可溶性蛋白）第十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日速度區(qū)帶離心法原理：在離心管預(yù)先裝入密度梯度材料（如蔗糖，CsCl等），樣品鋪在梯度液頂部。同梯度液一起離心，利用各顆粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的顆粒處于同一梯度層內(nèi)，達(dá)到分離目的。第二十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日密度梯度離心法(預(yù)制梯度)在離心之前在管中預(yù)先形成線性或非線性梯度,將樣品加入離心管中,經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間平衡離心,使樣品顆粒按其密度不同在梯度液中分布,這時(shí)顆粒密度等于周圍介質(zhì)的密度ρp=ρm第二十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日密度梯度離心法(離心自成)利用某些重金屬鹽(如Cscl等)同樣品均勻混合,長(zhǎng)時(shí)間離心.在離心場(chǎng)的作用下,重金屬鹽重新分布,最后形成由管底密度高到液面密度低的密度梯度.此時(shí),樣品中原先均勻分布的病毒顆粒隨周圍介質(zhì)密度的變化而上浮下沉,最終進(jìn)入與自身浮力密度相同的特定位置,只要轉(zhuǎn)速、溫度不變,則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些顆粒的成帶位置.第二十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日各類超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子最高轉(zhuǎn)速允許離心管內(nèi)平均密度為1.2g/cm3,超過(guò)該密度,減速

rpm實(shí)際=1.2/實(shí)際密度×rpmmax

轉(zhuǎn)子超過(guò)壽命也要減速使用轉(zhuǎn)速限制第二十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日HBV顆粒分離

1.差速離心分離:HBV陽(yáng)性血清用緩沖液對(duì)倍稀釋,4000rpm離心30min后,棄細(xì)胞碎片等大沉淀塊.上清液再經(jīng)40000rpm離心3hr,使病毒顆粒沉淀,得到粗病毒液.2.速度區(qū)帶分離:在離心管中加入70%(w/v)蔗糖2ml,上加20%(w/v)蔗糖4ml,將粗病毒液加在梯度液頂部,于30,000rpm離心4hr.收集20%與70%(w/v)蔗糖中間混濁的中間層.第二十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

3.預(yù)制梯度等密度離心分離:制備蔗糖密度梯度液,SW41轉(zhuǎn)頭100,000g離心24小時(shí)后,分部收集.選擇合并密度管作電鏡觀察.第二十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日預(yù)制梯度等密度離心分離:

石蠟油樣品0.5ml30%蔗糖2ml40%蔗糖2ml50%蔗糖2ml60%蔗糖2ml70%蔗糖1ml

第二十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日梯度液的密度測(cè)定1.微量取樣器法精密加樣器,萬(wàn)分之一或十萬(wàn)分之一秤恒溫,用純水作對(duì)照.2.比重稱法3.折光儀法(Abbe折光儀)

ρ=an-b

n:液體的折光率a,b:常數(shù)隨介質(zhì)而異對(duì)溫度敏感第二十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第二十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第二十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日冠狀病毒：+RNA病毒，包膜病毒

75%酒精可以滅活該病毒第三十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月