畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

性的蛋白，就需要進(jìn)展變性溶解及復(fù)性等操作，這一過(guò)程比較繁瑣，同時(shí)增加了本錢。利于真核基因的表達(dá)，能有效抑制大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻澤后加工、修飾的缺乏。因此酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來(lái)越多的重視和利用。過(guò)大腸桿菌表達(dá)的，其主要優(yōu)點(diǎn)是本錢低、產(chǎn)量高、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等處理，才能應(yīng)用。近年來(lái)，以酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白日益引起重視，等等間題［1］。酵母也最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主．1981年釀酒酵母表達(dá)了第一個(gè)外源基因一干擾素基因，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，而大多數(shù)外源基因的高效表達(dá)需要高拷貝數(shù)的維特，因此引起量的下降。為抑制釀酒酵母的局限，人們進(jìn)展了以甲基養(yǎng)分型酵母〔methylotrophicyeast〕代表的其次代酵母表達(dá)系統(tǒng)［2］。甲基養(yǎng)分型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris〔畢赤巴斯德酵母〕為宿主的外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)［1、2、3］；⑴具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一。⑷畢赤酵母中存在過(guò)氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且削減對(duì)細(xì)胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)近十年進(jìn)展，已根本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOX1，已高效表達(dá)了HBsAg、TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素C片段、基因工程抗體等多種外源基因，證明該系統(tǒng)為高效、有用、簡(jiǎn)便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且格外適宜子擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模［4］。目前美國(guó)FDACephelon制劑已獲得FDA以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的．Pichia.pastoris表達(dá)系統(tǒng)在生物工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來(lái)越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，供給更為廣泛的基因工程產(chǎn)品［2、3］。近年來(lái)，Invitrogon公司開發(fā)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾年已經(jīng)有300多種外源蛋拘束該系統(tǒng)得到有效表達(dá)，被認(rèn)為是目前最有效的酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4養(yǎng)分缺陷標(biāo)記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)彼ARG4基因插入，表型Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無(wú)自然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)［5］．包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號(hào)肽序列。達(dá)需要在外源蛋白的N中所使用pPICZαA質(zhì)粒，其信號(hào)肽來(lái)自釀酒酵母的α-交配因子〔α-factor〕，能很好的到達(dá)以上的要求。并且作為一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它還擁有一個(gè)特點(diǎn)是其具有Zeocin抗性標(biāo)記基因，給我們篩選轉(zhuǎn)化子的工作帶來(lái)很大的便利［1、2］。pPICZαA質(zhì)粒是作為一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它的主要特點(diǎn)簡(jiǎn)介如下：⑴具有強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOX1〔alcoholoxidase，醇氧化酶〕；⑵具有ZeocinZeocinYPDZ平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子中，100％都有外源基因的整合，大大簡(jiǎn)化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過(guò)程［5］。在操作過(guò)程中，Zeocin也可用來(lái)篩選含表達(dá)載體pPICZαA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，不必另外使用Amp，經(jīng)濟(jì)而又簡(jiǎn)便；。⑶在表達(dá)載體A0X15’端啟動(dòng)子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)下游A0X13’端終止序列；α-factor.Invitrogen公司開發(fā)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品作為目前被應(yīng)用為最為廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，其主要的優(yōu)點(diǎn)有：醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。外源基因整合在酵母基因組上，可以穩(wěn)定存在。同時(shí)，高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后，進(jìn)展翻譯一．畢赤酵母表達(dá)常用溶液及緩沖液的配制各種母液的配制10*YNB 〔含有硫酸銨、無(wú)氨基酸的13.4%酵母根底氮源培育基〕4℃保存。34g酵母根底氮源培育基〔無(wú)硫酸銨〕+100g1000ml500*B 〔0.02%生物素Biotin〕 4℃保存保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過(guò)濾除菌。100*H〔0.4%Histidine組氨酸〕4℃1400mg的L100ml水中，〔加熱至50℃以促進(jìn)溶解〕，過(guò)濾除菌。10*D 〔20%Dextrose葡萄糖〕保存期為1200g1000ml15min10*M 〔5%Methanol甲醇〕保存期為25ml95ml過(guò)濾除菌。10*GY〔10%Glycerol甘油〕1100ml900ml后，高壓滅菌或過(guò)濾除菌。100*AA〔0.5%ofeachAminoAcid，各種氨基酸〕4℃1別將500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過(guò)濾除菌。1M磷酸鉀溶液〔potassiumphosphatebuffer，pH6.0〕，1mol/LK2HPO4132ml1mol/LKH2PO4868mlpH6.0pHpH。常用溶液及緩沖夜堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA所用溶液：溶液Ⅰ：50mmol/Lglucose，100mmol/LEDTA，25mmol/LTris－HCI(pH8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／LNaOH，1SDS〔臨用時(shí)配制〕溶液Ⅲ：29.44gKAc，11.5mlAceticacidddH2O100ml。4℃保存。10%甘油〔Glycerol〕：100ml900ml1Rnase-H2O：1ulRnase1ml滅菌ddH2O。4℃保存。TE10mmol/Tris-CI〔pH8．0〕，lmmol/L EDTA〔pH8.0〕STE0.1mol/L, 10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)SCE1mol/LSorbitol(山梨醇),10mmol/L10mmol/LEDTA1Mpotassiumphosphatebuffer〔pH6.0〕：132ml1M K2HPO4868ml1M KH2PO450XTAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液，pH8.0〔1L〕：242g Tris57.1ml AceticAcid37.2g EDTA二．畢赤酵母表達(dá)的培育基配制［5］培育基：Trypton l％YeastExtract NaCl PH7.0制作平板時(shí)參加2％瓊脂粉。121℃高壓滅菌20min?？捎谑覝乇４?。用于培育pPICZαA原核宿TOP10F’Zeocin25ug/ml。LLB〔LowSaltLB〕培育基：Trypton l％YeastExtract 0.5％NaCl 0.5％PH7.0制作平板時(shí)參加2％瓊脂粉。121℃高壓滅菌20min。可于室溫保存數(shù)月。用于培育pPICZαATOP10F’Zeocin25ug/ml4℃1～2YPD〔YEPD〕YeastExtractPeptoneDextroseMedium，〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培育基〕Trypton 2%dextrose(glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100μg/mlYPDYPD4℃Zeocin100ug/ml，成YPDZ4℃1～2YPDSZeocin培育基〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium〕：yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%+Zeocin100μg/mlYPDSYPDS+Zeocin培育基，都必需存放4℃1～2周。MGYMinimalGlycerolMedium〔最小甘油培育基〕〔34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素〕800ml100ml10*YNB2ml500*B100ml的10*GY，4℃保存，保存期為2MGYHMinimalGlycerolMediumHistidine〔0.004%組氨酸〕1000mlMGY10ml100*H，4℃2RDRegenerationDextroseMedium〔葡萄糖再生培育基〕〔含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸〕186g700ml，高壓滅菌；冷卻后于45℃水?。粚?00ml的10*D100ml的10*YNB2ml的500*B10ml的100*AA等母液和88ml無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4℃保存。RDHRegenerationDextroseMediumHistidine〔0.004%組氨酸〕RD10ml的100*H78ml即可，RD4℃保存。RDRDH將186g的山梨醇和15~20g瓊脂粉定容至700ml60℃水浴；RD/RDH4100ml10*D、100ml10*YNB；2ml500*B；10ml100*AA〔10ml100*H〕88〔78〕ml45℃1/瓊脂液混勻；快速制備平板。4℃可保存數(shù)月。RD及RDH的TOP瓊脂的制備〔常用于酵母菌的包被〕186g7.5~10g700ml60℃水??；參照RD/RDH液體培育基配制的步驟4100ml的10*D100ml的10*YNB2ml的500*B10ml100*AA等母液、〔10ml的100*H母液〕88〔78〕ml無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1/瓊脂液混勻；將該TOP瓊脂置于45℃水浴冷卻、保溫，備用。MD與MDHMinimalDextroseMedium+〔Histidine〕 最小葡萄糖培育基+〔0.004%組氨酸〕〔含有：1.34%YNB；；4*10-5%生物素；2%葡萄糖〕100ml10*YNB；2ml500*B100ml10*D800ml1000mlMDHMD10ml100*H如配制平板，可無(wú)菌水的滅菌前，參加15~20g的瓊脂。4℃可保存數(shù)月。SOC0.05％121℃20min，冷卻后，4℃保存三．主要試驗(yàn)環(huán)節(jié)的操作酵母菌株的分別純化

Trypton l％YeastExtract NaClGlucose(1mol/L) 2%GS1155mlYPD，30℃，200rpm振蕩過(guò)夜，涂布YPD，30℃培育48小時(shí)，用YNB根本培育基和含His的補(bǔ)充培育基作點(diǎn)種分別純化，選擇在補(bǔ)充培育基生上生YPD，4℃保存。pPICZαATOP10F’的活化培育TOP10F’做為菌種保存在－70TOP10F’5mlLLB〔25ug/mlZeocin〕中，37℃，200rpm，培育16～18畢赤酵母表達(dá)的試驗(yàn)方法線狀質(zhì)粒DNA的脫磷酸化處理為了防止載體質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，用小牛腸堿性磷酸酶〔CIP〕處理酶切后的質(zhì)粒DNA，具體操作如下：線性化的質(zhì)粒 35ul10xCIPbuffer 4ulCIP1ul5ul

ddH2O——————————————————————————total 45ul⑵在PCR〔加石蠟油封閉〕，37℃，15min；50℃，15min；56℃，30min〔滅活〕。⑶在56℃proteinseK，用于滅活CIP，參加試劑如下：反響物 45ul10x5％SDS 7ul10xEDTA〔pH8.0〕 7ulproteinseK 6ul———————————————————

ddH2Ototal 70ul⑷純化使用QIAquickspinkit，依據(jù)20ul滅菌ddH2O1％瓊脂糖凝膠電泳，120VDNAE.coliTOP10F’⑴取10ulTOP10F’菌液，接種于200mlLB，37℃，200rpm，16～18100ul200mlLB⑵37℃，200rpm16～18⑶滅菌500ml離心管，4℃，4000rpm，20min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10％甘油重3⑷第三次離心后，棄絕大局部上清，留下約1ml液體用于重懸菌體。⑸從制得得感受態(tài)細(xì)胞中，取200ulEP管中，參加連接反響產(chǎn)物5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。⑹將混勻后得200ul2500V5ms。⑻電擊后，往電擊杯中參加800ulSOC1.5mlEP37℃，150rpm45～60min。⑼取全部均勻涂布于含Zeocin25ug/ml的LLB－Zeocin37℃12～16*注：設(shè)空載體做比照。畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法菌體的預(yù)備：挑取酵母單菌落，接種至含有5mlYPD50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min取100~500μl的培育物接種至含有500ml穎培育基的2L28~30℃250~300r/minOD6001.3~1.5；將細(xì)胞培育物于4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用1ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體1.5ml；備注：可將其分裝為80μl一份的包裝冷凍起來(lái)，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率〔2周之內(nèi)〕。電擊轉(zhuǎn)化：5~20μgDNA5~10μlTE80μl60.2cm將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；依據(jù)電轉(zhuǎn)化儀供給的資料，參考其他文獻(xiàn)及屢次摸索，確定適宜的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)展電擊；1ml1.5ml的EP管中；MDRDB200~600μl涂布一塊平板；將平板置于30℃培育，直至單個(gè)菌落消滅。推舉：電壓1.5kV；電容25μF；電阻200Ω。電擊時(shí)間為4～10msec。PichiaPCR模板的處理：平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)〔約12小時(shí)〕；使用基因的特異性引物〔這樣做可以鑒定非定向克隆的方向〕；PCR1.5PCR1.5PCR，1％agarose1.55YPDZ，308－12鑒定確認(rèn)。留意：本試驗(yàn)方法應(yīng)用在需要挑取的克隆較多〔也就是克隆效率低〕，使用PCR初篩可以使工作量大為降低。PCR反響體系：TaKaRaTaqDNA組分 50μl體系 20μl體系10xReactionBuffer5.0μl2.0μl25mmol/LMgCl23.0μl1.2μl2.5mmol/LdNTPs5.0μl3.0μlPrimer1〔10μmol/L〕2.5μl1.0μlPrimer2〔10μmol/L〕2.5μl1.0μlddH2O31.5μl12.6μlTaqDNA0.5μl0.2μlTOTAL50.0μl20.0μlPCR初始變性 94℃ 4min變性 94℃ 30s 34個(gè)循環(huán)退火 50~54℃30s延長(zhǎng) 72℃ 30s完畢延長(zhǎng) 72℃10min保存 4℃畢赤酵母基因組提取方法YPDZGS115YPD，30℃，16～181500g5-10minulβ-巰基乙醇，1ulLyticase，37℃30min。⑷10000g5~10min90ulTE⑸200ul飽和酚，200ul30s1/10NaAC，-20℃30min；⑺10000g20min，棄上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；15μlTEH2O，-20℃?zhèn)溆谩ut+表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)25mlMGY、BMGBMGY250ml搖瓶中，于rpmOD600=2-6(~16-18h)；OD600=1.0〔100~200ml〕；rpm24h100％0.5～1.0%；1ml，1.5mlEP0、6、12、24、36、48、60、72、8496h；測(cè)樣品用液氮或干冰速凍后，于-80°CSDS-、Western-Blot3.7Muts25mlMGY、BMGBMGY250ml搖瓶中，于rpmOD600=2-6(~16-18h)；1/51/10MM、BMMBMMY〔10~20ml〕；28-30°C/250-300rpm24h100％0.5～1.0%；1ml，1.5mlEP時(shí)間點(diǎn)一般?。?、24、48、72、96120h；對(duì)分泌表達(dá)，分別樣品的上清液；對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分別樣品的菌體沉淀，帶檢測(cè)樣品用液氮或干冰速凍后，于-80°C保存?zhèn)溆?；SDS-、Western-Blot試驗(yàn)的留意事項(xiàng)信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì)PCRpPICZαAKEX2Lys－Arg，Lys、ArgAAA、AGA。酵母細(xì)胞膜中中的KEX2蛋白酶是α-factor信號(hào)肽的切割酶，它能有效識(shí)別酶切位點(diǎn)Lys－Arg，通過(guò)對(duì)信號(hào)肽的切割使基因表達(dá)產(chǎn)物釋放至胞外。PCR、P4rhEGFXhoⅠ、XbaⅠ5PCR5”端限制酶導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)的殘缺。NEB(NewEnglandBiolabs)公司在限制酶領(lǐng)域的NEB產(chǎn)品名目后面的附錄：CleavagetotheendofDNAfragments進(jìn)展［7］，但設(shè)計(jì)保護(hù)堿基。本次試驗(yàn)中，依據(jù)美國(guó)基因動(dòng)力試驗(yàn)室文獻(xiàn)的報(bào)道NheISpeI5’55’5證較高的酶切效率。高保真DNA聚合酶的使用DNADNATaqDNATthDNA聚合酶及其變體AmpliTaq，KlenTaq等都無(wú)3’至5’糾錯(cuò)功能，因此在擴(kuò)PCRDNAPCRDNADNA［9］。DNAPfu，DeepVent，Pwo，UlTmaPfuTaqDNA10hEGF在hEGFVentDNA〕，質(zhì)粒構(gòu)DNAPCRDNA構(gòu)建效率將有質(zhì)的飛躍。密碼子的偏好性的原則義,也為改造外源基因或改造宿主細(xì)胞供給依據(jù)［10、11］。線性化及承受電轉(zhuǎn)化的緣由：SacⅠ進(jìn)展線性化的處理。線性化處理。這種處理的目的：⑴防止隨機(jī)插入重組時(shí)質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達(dá)失活；⑵讓同源重組以指定的方式發(fā)生。主要步驟如下：1〕酶切體系〔80ul〕21/10PH5.2NaAC，混勻2013200rpm，20min，離心后棄上清300ul5min，棄上清