實(shí)驗(yàn)四酸性磷酸酶及值測(cè)定

實(shí)驗(yàn)四酸性磷酸酶及值測(cè)定第一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日酸性磷酸酶：

催化磷酸單酯的水解反應(yīng)存在于人的肝臟，前列腺等處植物中以發(fā)芽的種子中含量最為豐富。

是生物體中重要的一種酶類，為某些疾病的檢測(cè)指標(biāo)。一、概述第二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日酶液磷酸苯二鈉苯酚＋磷酸氫二鈉

folin-酚測(cè)定酚的濃度

計(jì)算出反應(yīng)速度（用產(chǎn)物生成量/min來(lái)表示）

根據(jù)雙倒數(shù)法計(jì)算出Km及Vmax二、實(shí)驗(yàn)原理第三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日第四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日

V=Vmax[S][S]Km+第五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線3、制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線4、[S]與V0關(guān)系實(shí)驗(yàn)

5、雙倒數(shù)作圖法計(jì)算Vmax和Km

第六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日buffersubstrateenzymeCertainTimeblankStopthereactionColordeveloped第七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日生化實(shí)驗(yàn)課老師：于曉虹實(shí)驗(yàn)報(bào)告請(qǐng)交到講臺(tái)上來(lái)酶液稀釋取上清液３００微升，稀釋３０倍，用大試管裝科代表李博恒第八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日

1、磷酸酶原液的制備：稱取5g綠豆芽莖（去頭去根），加入pH5.6的HAC緩沖液2ml研磨成漿并靜置30分鐘。紗布過(guò)濾，取1.8ml濾液,以6000rpm，離心20min，取上清。上清液用pH5.6的HAC緩沖液稀釋30倍，用于實(shí)驗(yàn)。第九頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日2、制作酶反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線（目的：選取合適的反應(yīng)時(shí)間）第十頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日加液程序表管號(hào)1234560磷酸苯二鈉0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.50.50.50.50.50.5精確反應(yīng)時(shí)間3510152025碳酸鈉溶液2222222酶液－－－－－－0.5Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5

Folin－酚溶液已稀釋好！注：進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始35℃保溫10分鐘第十一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日0123456反應(yīng)時(shí)間03510152025吸光度結(jié)果：以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，繪制反應(yīng)進(jìn)程曲線，并從該曲線上求出酸性磷酸酶反應(yīng)初速率的時(shí)間范圍。第十二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日3、制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線（目的：可從酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出A680nm所相當(dāng)?shù)姆雍?并計(jì)算出反應(yīng)速度（用每分鐘產(chǎn)物生成量來(lái)表示）第十三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日0123456780.4mMphenol

standardsolution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21MNa2CO3222222222Folin-phenolreagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加液程序表35℃保溫10分鐘第十四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日012345678酚含量/μmol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度結(jié)果：以酚含量（μmol）為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0號(hào)管作空白，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)680nm波長(zhǎng)處讀取各管的吸光度（A680nm）。第十五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日4、[S]與V0關(guān)系實(shí)驗(yàn)第十六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)加液程序表管號(hào)1234560磷酸苯二鈉0.100.150.200.250.300.500.50醋酸緩沖液0.400.350.300.250.20--酶液0.500.500.500.500.500.50-

精確反應(yīng)15分鐘35度碳酸鈉溶液2222222Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5酶液－－－－－－0.5

35℃保溫10分鐘測(cè)680nm處吸光度

注：進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始第十七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)中需注意事項(xiàng)：酶反應(yīng)作用時(shí)間精確控制

第十八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日Tubenumber123456[S](mM)0.50.7511.251.52.51/