藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析

藥品分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)深度剖析藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析1/32一、線性試驗(yàn)主成份含量測定以測定濃度為100%，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。

溶出（釋放）度測定以釋放量10%～120%間選取5個(gè)點(diǎn)即可。

雜質(zhì)含量用雜質(zhì)對照品準(zhǔn)確測定以雜質(zhì)程度為100%，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析2/32測定結(jié)果：

1）闡述怎樣對待截距和斜率、怎樣應(yīng)用。

2）誤差在哪里，應(yīng)用時(shí)注意事項(xiàng)。

3）為何沒有不成線性？通常C、H、O、N結(jié)構(gòu)，紫外監(jiān)測器決定。

個(gè)別化學(xué)鍵所致。梯度洗脫時(shí)，有時(shí)會出現(xiàn)不成線性。

4）都成線性、為何還要做？最小二乘法原理知曉。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析3/32唑來磷酸結(jié)構(gòu)式藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析4/32引申使用：

1）相關(guān)物質(zhì)測定歸一化法和本身對照法相互妙用。

2）緩釋制劑溶出度測定，對照品濃度設(shè)定為中間濃度。舉例說明。

3）回收率試驗(yàn)為何做80%~120%即可？亦及樣品濃度與對照品濃度靠近到何等程度了解。

4）國內(nèi)只重視相關(guān)系數(shù)，不重視截距。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析5/32二、精密度試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次。

中間精密度試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)經(jīng)過“耐用性試驗(yàn)中溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)”來表達(dá)。

濃度極低時(shí)才會不理想，加大進(jìn)樣量。

色譜峰形極為主要，對稱性、柱效等參數(shù)。加大柱溫、增加流動(dòng)相中有機(jī)相百分比，使被測物質(zhì)峰盡快出峰。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析6/32三、準(zhǔn)確度試驗(yàn)用回收率來衡量作法：在80%~120%間選擇3點(diǎn)或5點(diǎn)，原因是由外標(biāo)一點(diǎn)法決定。

已知雜質(zhì)、且有雜質(zhì)對照品，可采取加入法，即加樣回收率來評價(jià)。

普通情況下，只要空白輔料無干擾，回收率均是良好！藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析7/32四、專屬性相關(guān)物質(zhì)為主，其它檢測項(xiàng)目（含量）基本上均參考相關(guān)物質(zhì)。

相關(guān)物質(zhì)驗(yàn)證，采取中間體和降解產(chǎn)物（確認(rèn)結(jié)構(gòu)后人工合成）來驗(yàn)證與主成份分離。

藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析8/32系統(tǒng)適用性試驗(yàn)配制方法：

在100％濃度主成份溶液中加入1%濃度雜質(zhì)對照品，以模擬樣品中有可能存在狀態(tài)。

介紹配制方法——先配制雜質(zhì)貯備液，再用供試品溶液（或濃對照品溶液）來稀釋，簡便、易行！藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析9/32專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析10/32存在問題——配制相同濃度，測定樣品時(shí)，主成份峰驟然加大，將雜質(zhì)峰覆蓋。

強(qiáng)破壞試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：

驗(yàn)證藥品在遭遇了極端氣候環(huán)境條件下產(chǎn)生雜質(zhì)，在所建立色譜條件下是否能夠分離、測定。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析11/32●檢測波長確實(shí)定

包括到各被檢測物質(zhì)在該波長下響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子問題。（f=A雜質(zhì)/A被測成份）

選取主成份與各雜質(zhì)含有相同紫外吸收波長（f=1.0）。

選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成份紫外吸收波長（f>1.0），這么可愈加嚴(yán)格控制雜質(zhì)程度。

如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成份紫外吸收波長，應(yīng)必須加入重量校正因子（f<1.0），不然將得到錯(cuò)誤判斷。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析12/32介紹該項(xiàng)檢測由來和歷史背景

要看主峰里是否有雜質(zhì)，怎樣判斷？但需注意DAD檢測器不足，介紹“土方法”！

結(jié)果：當(dāng)前從來沒有推翻現(xiàn)行色譜條件。意義在哪里。怎樣應(yīng)用，拿到只是“走形式”？藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析13/32最小峰面積設(shè)定

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其設(shè)定，不是絕對值，而是相對值。

●英國藥典中有明確說明：凡相關(guān)物質(zhì)檢測采取HPLC法測定時(shí)，均要求舍棄對照溶液主峰面積幾分之幾峰面積。普通樣品測定時(shí)，通常為1/10~1/20（即相當(dāng)于樣品測定濃度0.1%~0.05%）。如要求雜質(zhì)程度為1.0%，對照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定為1000~500左右。新藥穩(wěn)定性考評時(shí)，可設(shè)定到0.01%最小峰面積。

●原料藥銷售與購置協(xié)議中，為確保雙方達(dá)成一致意見，此點(diǎn)應(yīng)給予重視。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析14/32強(qiáng)力破壞試驗(yàn)

●水破壞取原料適量，加水溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●氧化破壞取原料適量，用5%過氧化氫溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●強(qiáng)堿破壞取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●強(qiáng)酸破壞取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。

●高溫破壞取原料適量，依據(jù)各自品種熔點(diǎn)不一樣，在高溫下破壞至外觀性狀改變

●強(qiáng)光破壞取原料適量，置紫外燈下照射48小時(shí)。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析15/32四、檢測限●

信噪比三倍——純屬“紙上談兵”，實(shí)際測定中根本用不上。

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是相對值，不是絕對值。是相對于供試品溶液濃度多少分之一而言，普通最少要在5000倍以上。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析16/32相關(guān)物質(zhì)、含量與本身對照三者濃度關(guān)系藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析17/32積分參數(shù)設(shè)定●積分參數(shù)設(shè)定是非常主要。由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(MinArea)組成?！癫扇”旧韺φ辗〞r(shí)，對照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進(jìn)行積分計(jì)算?！窆┰嚻啡芤鹤钚》迕娣e設(shè)定將直接造成測定結(jié)果。設(shè)定得太小，會造成很多小峰甚至是基線漂移小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而造成雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定得過大，又將反應(yīng)不出雜質(zhì)情況。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析18/32方法學(xué)認(rèn)證中耐受性試驗(yàn)

是指更換試驗(yàn)原因，如不一樣人員、不一樣儀器，不一樣色譜柱型號、廠家，不一樣試劑等原因。這一點(diǎn)才是真正至關(guān)主要！認(rèn)證時(shí)不可能做到這一點(diǎn)，出現(xiàn)問題時(shí)往往要考慮到。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析19/32方法學(xué)認(rèn)證中溶液穩(wěn)定性全方面判定不能單從主成份入手！還要注意全部組分百分比改變，絕對值改變！藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析20/32雜質(zhì)-1（為已知雜質(zhì)）青蒿琥酯雜質(zhì)-2雜質(zhì)-3新雜質(zhì)時(shí)間(h)峰面積百分比峰面積百分比峰面積百分比峰面積百分比均未檢出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.16%591850.56%4500020.42%RSD0.96％藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析21/32流速、柱溫與溶劑選擇●在測定時(shí)通常調(diào)整流速使主成份保留時(shí)間稍長些，且使主成份峰不拖尾即可?！裰鶞貙Ψ蛛x效果影響雖有一定影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超出35℃?！袢軇┻x擇應(yīng)測定樣品溶液在該溶劑中穩(wěn)定性來衡量，盡可能勿選擇揮發(fā)性強(qiáng)溶劑；同時(shí)應(yīng)確保對照溶液主成份峰面積精密度良好。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析22/32質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂相關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)●采取雜質(zhì)對照品法、用于降解產(chǎn)物準(zhǔn)確測定，如氫氯噻嗪、對乙酰氨基酚等?！癫扇?qiáng)破壞試驗(yàn)破壞出雜質(zhì)。如中國藥典中氧氟沙星全部品種，均在HPLC法色譜條件下確定了：取供試品溶液，置紫外燈下（254nm）照射4小時(shí)以上，使產(chǎn)生緊鄰主峰前雜質(zhì)峰與主峰分離度應(yīng)符合要求?！癫徊扇∪魏畏绞?。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析23/32經(jīng)典強(qiáng)破壞試驗(yàn)圖譜藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析24/32藥品含量測定方法設(shè)計(jì)——原料藥原料藥:對于組份單一原料藥,首選容量法測定含量強(qiáng)調(diào)：（1）供試品取用量應(yīng)滿足滴定精度要求（消耗滴定液約20ml）；（2）滴定終點(diǎn)判斷要明確，如選取指示劑法，應(yīng)考慮其變色敏銳，提供滴定曲線，并用電位法校準(zhǔn)其終點(diǎn)顏色。（3）為排除因加入其它試劑或混入雜質(zhì)對測定結(jié)果影響，或便于剩下滴定法計(jì)算，可采取“將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正”方法；（4）最終要給出滴定度（采取四位有效數(shù)字）。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析25/32容量法測定含量要注意參加反應(yīng)應(yīng)是藥品分子活性部分，而不應(yīng)是次要酸根或堿基部分。如鹽酸氨溴索，有研究者采取氫氧化鈉滴定液測定其含量，實(shí)際上這種方法測定是其中鹽酸含量，因?yàn)槠涑甥}工藝中酸、堿配比不妥時(shí)，可嚴(yán)重影響成品酸堿度，故測定結(jié)果并不能代表其活性成份有機(jī)堿含量。應(yīng)采取非水滴定法，以無水冰醋酸為溶劑屏蔽掉鹽酸干擾，用高氯酸滴定其有機(jī)堿含量。高氯酸非水滴定法因適應(yīng)性廣（適合用于有機(jī)弱堿及其鹽類）在化學(xué)原料藥含量測定中較為慣用。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析26/32如用容量法不宜時(shí)，可考慮選取HPLC法，尤其在相關(guān)物質(zhì)干擾，或多組份物質(zhì)時(shí)，含有特殊優(yōu)勢。普通不選取UV法，尤其不首選“吸收系數(shù)法”定量，不選取末端吸收峰作測定波長；須用UV法時(shí)，可采取不受儀器及其它改變影響“對照品比較法”定量，測定溶液吸收度宜在0.3～0.7間。元素測定法如定氮法，在其它方法均不宜時(shí)可采取，但因不能反應(yīng)化合物含量改變情況，此法不可用于穩(wěn)定性考查中。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析27/32藥品含量測定方法設(shè)計(jì)——制劑應(yīng)考慮輔料等干擾，首選方法普通為HPLC法，在相關(guān)物質(zhì)、輔料不干擾情況下，也可選取UV法或原料藥項(xiàng)下容量法。復(fù)方制劑首選HPLC法。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析28/32藥品含量測定方法設(shè)計(jì)——驗(yàn)證訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定法不一樣于普通質(zhì)量考查方法，須經(jīng)過嚴(yán)格方法學(xué)驗(yàn)證。容量分析法驗(yàn)證：①精密度：用原料藥精制品（含量>99.5%）考查方法精密度，平行試驗(yàn)5個(gè)樣本RSD≤0.2%；②準(zhǔn)確度：以測定原料精制品回收率計(jì)算，應(yīng)在99.7%～100.3%之間（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定終點(diǎn)確定依據(jù)：包含滴定曲線繪制，如用指示劑法確定終點(diǎn)，應(yīng)用電位法校準(zhǔn)終點(diǎn)顏色，提供指示劑顏色與電位改變情況對比結(jié)果；藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析29/32④耐用性：考查測定條件（供試液穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等）有微小變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響承受程度，如測試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明。HPLC法驗(yàn)證：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②準(zhǔn)確度：用于制劑時(shí)，要考查輔料影響，將一定量藥品加到按處方百分比配制輔料中（為標(biāo)示量80%～120%）制成高、中、低三個(gè)劑量，混合均勻后，每個(gè)劑量取三份樣品，按確定方法測定回收率，應(yīng)在98%～102%之間（n＝9,RSD≤2%）。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析30/32③線性范圍：用已知含量精制品配制一系列濃度溶液（n＝5～7），用濃度C對峰面積A或峰高h(yuǎn)或被測物響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，線性方程相關(guān)系數(shù)r≥0.9990，截距越小越好，并提供線性關(guān)系圖；④專屬性：輔料、相關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物峰對主藥峰應(yīng)無干擾；⑤耐用性：考查測定條件（供試液穩(wěn)定性、流動(dòng)相組成和pH值、不一樣品牌或批號同類色譜柱、柱溫、流速、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等）有微小變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響承受程度，如測試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明；⑥靈敏度：作為常量分析法，此項(xiàng)可不作主要要求。藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析31/32UV法驗(yàn)證：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②準(zhǔn)確度：方法同HPLC法，回收率應(yīng)在98