第七章-微生物的遺傳變異與育種

第七章微生物的遺傳變異與育種第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)其次節(jié)基因突變和誘變育種第三節(jié)基因重組和雜交育種第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏志向的工業(yè)發(fā)酵菌種應(yīng)符合以下要求：①遺傳性狀穩(wěn)定；②生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；③目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率；④目標(biāo)產(chǎn)物最好能分泌到細胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利于分別；⑤盡可能削減產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量，以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量并利于分別；⑥培育基成分簡潔、來源廣、價格低廉；⑦對溫度、pH、離子強度、剪切力等環(huán)境因素不敏感；⑧對溶氧的要求低，便于培育及降低能耗。遺傳與變異的概念遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形態(tài)的遺傳信息。特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和；------是一種內(nèi)在可能性或潛力。遺傳型+環(huán)境條件表型表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;------是一種現(xiàn)實存在，是具確定遺傳型的生物在確定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。代謝發(fā)育變異(variation):生物體在外因或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生變更。變異的特點：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.形態(tài)變更的幅度大；c.變更后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變更而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變更。特點是：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變更；b.性狀變更的幅度??；c.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消逝后，表型即可復(fù)原。例如：粘質(zhì)沙雷氏菌：在25℃下培育，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培育，不產(chǎn)生色素；假如重新將溫度降到25℃，又復(fù)原產(chǎn)色素的實力。遺傳與變異的概念微生物的獨特生物學(xué)特性：（1）個體的體制極其簡潔；（2）養(yǎng)分體一般都是單倍體；（3）易于在成分簡潔的組合培育基上大量生長繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物；（6）菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性；（7）環(huán)境條件對微生物群體中各個個體作用的干脆性和均一性；（8）易于形成養(yǎng)分缺陷型；（9）各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒；（10）存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式；微生物是探討現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它很多主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的探討對象。對微生物遺傳規(guī)律的深化探討，不僅促進了現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展，而且為育種工作供應(yīng)了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機到定向、從近緣雜交到遠緣雜交的方向發(fā)展。探討微生物遺傳學(xué)的意義第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883－1889年間Weissmann提出。認為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。基因?qū)W說：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)覺了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合，可以演化出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達到一個天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡潔得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當(dāng)時認為確定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，先后有利用微生物為試驗對象進行的三個著名試驗的論證（肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗、噬菌體感染試驗、病毒的拆開與重建試驗），才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì)。1928年，Griffith進行了以下幾組試驗：（1）動物試驗

對小鼠注射活RII菌或死SIII菌————小鼠存活

對小鼠注射活SIII菌————————小鼠死亡

對小鼠注射活RII菌和熱死SIII菌———小鼠死亡

抽取心血 分別

活的SIII菌一、證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個經(jīng)典試驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗（transformation）：F.Griffith，探討對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）SIII型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：無莢膜，菌落表面粗糙，無致病性Griffith轉(zhuǎn)化試驗示意混合培育RII型活菌SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死（2）細菌培育試驗（3）S型菌的無細胞抽提液試驗以上試驗說明：加熱殺死的SIII型細菌細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入RII型細胞并使RII型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾III型細胞。熱死SIII菌—————不生長

活RII

菌—————長出RII菌

熱死SIII菌—————長出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌無細胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培育①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，并在離體條件下進行了轉(zhuǎn)化試驗：只有S型細菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子。（二）噬菌體感染試驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染試驗（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性（三）植物病毒的重建試驗為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進行了著名的植物病毒重建試驗。將TMV在確定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分別。分別后的RNA在沒有蛋白質(zhì)包袱的狀況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分別出正常病毒粒子。

選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：

（1）RNA（TMV）-蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV）-蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分別到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分別到正常HRV粒子。上述結(jié)果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。（一）核酸存在的七個水平及質(zhì)粒細胞水平：存在于細胞核或核質(zhì)體，單核或多核細胞核水平:原與真核生物的細胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或袒露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制實力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平： 信息單位,起始和終止,核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基二、遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的存在部位和方式核外DNA的種類核外染色體真核生物的“質(zhì)粒”原核生物的質(zhì)粒

線粒體細胞質(zhì)基因 葉綠體（質(zhì)體） 中心體 動體共生生物： 卡巴顆粒酵母菌的2m質(zhì)粒F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)?；颍耗軌虮磉_和產(chǎn)生基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或RNA）的DNA序列。原核生物基因系統(tǒng)： 啟動子（基因） 操縱子 操縱子（基因）基因調(diào)控系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)基因 調(diào)整基因CABSummaryA:RNApolymeraseB:lacrepressorC:CRP-cAMP細胞水平：大部分或全部DNA都集中于細胞核或核質(zhì)體中，不同種類微生物或同種不同細胞中細胞核的數(shù)目不同染色體水平：真核微生物的每個細胞核內(nèi)含有確定數(shù)量的染色體；而原核微生物中一個核質(zhì)體就是一個袒露的、光學(xué)顯微鏡下不能看到的環(huán)狀染色體。一些真核生物和原核生物基因組的比較生物單倍體的分子量核苷酸已知染色體數(shù)約數(shù)（Da）對數(shù)基因數(shù)人 32 3－5×10125－7×109

－4000

黑腹果蠅4 7.9×10108.0×1075000－6000粗糙脈孢菌 7 2.8×10104.5×107>500

大腸桿菌 1 2.5×109 3.8×106

－1027

噬菌體T4 1 1.1×108 2.0×105

－135

噬菌體 1 3.2×1074.8×104

－35噬菌體MS2 1 1.1×1063.5×103 3 遺傳密碼：指DNA鏈上各個核苷酸的特定排列依次密碼子（coden）：由3個核苷酸依次確定，負載遺傳信息的基本單位不對稱轉(zhuǎn)錄：只有DNA雙鏈的一股才作為有意義鏈被轉(zhuǎn)錄，這種現(xiàn)象又稱不對稱轉(zhuǎn)錄。起始密碼子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸終止密碼子：UAA、UGA、UAG質(zhì)粒：細菌染色體外的遺傳物質(zhì)，由共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子組成，能獨立于細胞核進行自主復(fù)制。大?。悍肿恿考s為２—100×106D，攜帶1—100個基因,一個菌細胞可有一至數(shù)個質(zhì)粒。

質(zhì)粒的特點：可自我復(fù)制，穩(wěn)定遺傳。對生存不是必要的。復(fù)制與染色體分開，但同步進行。不同質(zhì)粒攜帶不同遺傳信息。無質(zhì)粒細菌可通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式獲得，不能自發(fā)產(chǎn)生。例：細菌抗藥性因子、大腸桿菌的F因子。質(zhì)粒應(yīng)用:基因工程，體外重組.三、原核生物的質(zhì)粒1.特點：①可以在細胞質(zhì)中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；②質(zhì)粒是一種復(fù)制子（replicon），依據(jù)自我復(fù)制實力的不同，可把質(zhì)粒復(fù)制的限制形式分為嚴緊型和松弛型兩種，嚴緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細胞核限制，與染色體DNA復(fù)制相伴隨,一般一個寄主細胞內(nèi)只有少數(shù)幾個（1－5）個拷貝；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細胞核限制，在染色體DNA復(fù)制停止的狀況下仍可以進行復(fù)制，在細胞內(nèi)的數(shù)量可以達到10－200個或更多。③可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個細菌細胞轉(zhuǎn)移到另一個菌細胞中，使兩個細胞都成為帶有質(zhì)粒的細胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時，它可以單獨轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。④對于細菌的生存并不是必要的⑤功能多樣化三、原核生物的質(zhì)粒2.質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用

質(zhì)粒在基因工程操作中的優(yōu)點：1.體積小，便于DNA的分別和操作；2.呈環(huán)狀，在化學(xué)分別過程中能保持穩(wěn)定性；3.有不受核基因組限制的獨立復(fù)制起始點；4.拷貝數(shù)多，使外源DNA可快速擴增；5.存在抗藥性基因等選擇性標(biāo)記，便于含質(zhì)粒克隆的檢出和選擇。E.Coli

的PBR322質(zhì)粒E.Coli的PBR322質(zhì)粒的具體優(yōu)點：1.體積小，僅4361bp；2.在宿主E.coli中穩(wěn)定地維持高拷貝數(shù)（20－30個/細胞）；3.氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)合成，則每個細胞可擴增到含1000－3000個質(zhì)粒；4.分別極其簡潔；5.可插入較多的外源DNA（不超過10bp）；6.結(jié)構(gòu)完全清晰，各種核酸內(nèi)切酶可酶解的位點可隨意選用；7.有兩個選擇性抗藥標(biāo)記（氨芐青霉素和四環(huán)素）；8.可便利地通過轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入宿主細胞。功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。存在范圍：很多細菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis、根癌土壤桿菌等制備：包括增殖、裂解細胞、分別質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟。鑒定：電鏡視察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法3.質(zhì)粒的分別與鑒定1.細菌的培育和收集

將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培育基(含50μg/mlAmp)中,37℃培育12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培育基(含50μg/mlAmp)中,37℃振蕩培育約12小時至對數(shù)生長后期。

2.溶菌：一般用溶菌酶去壁形成原生質(zhì)球或原生質(zhì)體3.堿變性處理：在SDS等表面活性劑存在下加NaOH溶液使pH升至12.4可使菌體蛋白和染色體DNA均不行逆變性而與質(zhì)粒DNA分開。4.離心分別：經(jīng)高速離心可以使細胞碎片和已變性的菌體蛋白和染色體DNA一道沉淀，上清液主要是質(zhì)粒DNA，經(jīng)乙醇沉淀后，可獲得質(zhì)粒DNA。1.瓊脂糖凝膠電泳DNA電泳速率排列：超螺旋、共價、閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)>缺刻環(huán)狀DNA(ocDNA)>線性DNA(LDNA)2.氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心3.電鏡視察4.質(zhì)粒的種類：

種類

代表菌1.接合性質(zhì)粒E.Coli的F質(zhì)粒；Pseudomonas（假單胞菌屬）的pfdm和K質(zhì)粒；Vibriocholerae（霍亂弧菌）的P質(zhì)粒；Streptomyces（鏈霉菌屬）的SCP質(zhì)粒2.抗藥性質(zhì)粒：抗抗生素，抗重金屬等離子腸道細菌和Staphylococcus（葡萄球菌屬）的R質(zhì)粒3.產(chǎn)細菌素和抗生素質(zhì)粒腸道細菌；Clostridium（梭菌屬）；Streptomyces4.具生理功能的質(zhì)粒利用乳糖、蔗糖、尿素、固氮降解辛烷、樟腦、萘、水楊酸產(chǎn)生色素結(jié)瘤和共生固氮

腸道細菌

PseudomonasErwinia（歐文氏菌），StaphylococcusaureusRhizobium（根瘤菌屬）5.產(chǎn)毒質(zhì)粒E.Coli，Staphylococcusaureus幾種代表性質(zhì)粒：1.F–因子（fertilityfactor）：又稱致育因子或性因子，是E.coli等細菌確定性別并有轉(zhuǎn)移實力的質(zhì)粒，62×106Da，94.5kb，相當(dāng)于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，確定性別。Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.

Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.F質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)又稱致育因子或性因子，是E.coli等細菌確定性別并有轉(zhuǎn)移實力的質(zhì)粒，62×106Da，99.15kb，相當(dāng)于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。（1）轉(zhuǎn)移區(qū)（3）插入?yún)^(qū)（2）復(fù)制區(qū)F因子(F-factor)

轉(zhuǎn)

重

移

IS3δ

組

IS3

區(qū)

區(qū)

OIS2

POriTOriV

復(fù)

區(qū)

制

最初發(fā)覺于痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae），后來發(fā)覺還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性確定R因子（r-determinant），RTF為分子量約為11×106Dalton，限制質(zhì)粒copy數(shù)及復(fù)制，抗性確定質(zhì)粒大小不固定，從幾百萬到100×106Dalton以上。其上帶有其它抗生素的抗性基因。R-因子在細胞內(nèi)的copy數(shù)可從1~2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_2000~3000個/細胞。2.R因子（resistencefactor）

RTF（含轉(zhuǎn)移和復(fù)制基因）+IS

R質(zhì)粒r確定因子（含抗藥性基因）產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細菌素，能通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細菌。其分子量約4×104－8×104Dalton。大腸桿菌素都是由Col因子編碼的。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1分子量約為5×106Dalton，無接合作用，是多copy的；ColE1探討得很多，并被廣泛地用于重組DNA的探討和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。ColIb分子量約為80×106Dalton，它與F因子相像，具有通過接合作用轉(zhuǎn)移的功能，屬于嚴緊型限制，只有1~2個copy。凡帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其損害。3.Col因子（colicinogenicfactor）即誘癌質(zhì)粒。存在于根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起很多雙子葉植物的根癌。當(dāng)細菌侵入植物細胞中后，在其細胞中溶解，把細菌的DNA釋放到植物細胞中。這時，含有復(fù)制基因的Ti質(zhì)粒的小片段與植物細胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞限制細胞分裂的激素調(diào)整系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細胞。Ti質(zhì)粒長200kb，是一個大型質(zhì)粒。當(dāng)前，Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程探討中的重要載體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到Ti質(zhì)粒中，并進一步使之整合到植物染色體上，以變更該植物的遺傳性，達到培育植物優(yōu)良品種的目的。5.Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）4.Ri質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒相像，存在于發(fā)根土壤桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌，其侵染雙子葉植物時，可誘發(fā)大量稱為毛狀根的不定根。其中Ri質(zhì)粒中的一段T-DNA整合到宿主根部細胞核基因組中，使之發(fā)生轉(zhuǎn)化，并在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定遺傳。是近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)覺的一種質(zhì)粒，分子量為200－300×106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。6.巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒）降解性質(zhì)粒只在假單胞菌屬中發(fā)覺。它們的降解性質(zhì)?？蔀橐幌盗心芙到饫щy物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質(zhì)粒，XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒，MDL（扁桃酸）質(zhì)粒，NAP（奈）質(zhì)粒和TOL（甲苯）質(zhì)粒等。7.降解性質(zhì)粒其次節(jié)基因突變和誘變育種突變（mutation）：指細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變更。染色體畸變——細胞學(xué)上可以看到染色體的變更突變基因突變——細胞學(xué)上看不到遺傳物質(zhì)的變更突變體（mutant）：發(fā)生了突變的微生物細胞或菌株野生型（wildtype）：從自然界分別到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株★依表型的變更分為：1.養(yǎng)分缺陷型——因突變而丟失產(chǎn)生某種生物合成酶的實力，并因而成為必需在培育基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型。2.抗性突變型——因突變而產(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性3.條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型4.形態(tài)突變型——由突變引起的個體或菌落形態(tài)的變異，一般屬非選擇性突變。5.抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變更。6.產(chǎn)量突變型——通過基因突變而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。7.發(fā)酵突變型——丟失產(chǎn)生某種生物合成酶實力的突變型。（一）基因突變的類型★按是否比較簡潔、快速地分別到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selectivemutant）：具有選擇標(biāo)記（如養(yǎng)分缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，如培育基、溫度、pH值等，就比較簡潔檢出和分別到。非選擇性突變株（non-selectivemutant）：無選擇標(biāo)記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。定義：每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。如一個含108個細胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個細胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10–8。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。在同一個細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，因為雙重突變型的幾率只是各個突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必需接受檢出選擇性突變株的手段，尤其是接受檢出養(yǎng)分缺陷型的回復(fù)突變株（backmutant或reversemutant）或抗性突變株特殊是抗藥性突變株的方法來加以確定。（二）突變率若干細菌某一性狀的自發(fā)突變率

菌名突變性狀突變率E.Coli

抗T1噬菌體3×10–8E.Coli

抗T3噬菌體1×10–7E.Coli

不發(fā)酵乳糖1×10–10E.Coli

抗紫外線1×10–5Staphylococcusaureus抗青霉素1×10–7S.Aureus

抗鏈霉素1×10–9

Salmonellatyphi

抗25g/L鏈霉素1×10–6

Bacillusmegaterium

抗異煙肼5×10–

5（三）突變的特點適用于整個生物界，以細菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變緣由之間無干脆的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會相互影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳?？赡嫘裕簭脑嫉囊吧突虻阶儺愔甑耐蛔兎Q為正向突 變（forwardmutation），從突變株回到野生型的 過程則稱為回復(fù)突變或回變（backmutation或 reversemutation）。（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當(dāng)長時間內(nèi)對這種抗性產(chǎn)生的緣由爭論特別激烈。一種觀點認為，突變是通過適應(yīng)而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的反抗對象）誘發(fā)出來的，突變的緣由和突變的性狀間是相對應(yīng)的，并認為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯綜在一起，所以難以探究問題的實質(zhì)。從1943年起，經(jīng)過幾個嚴密而奇妙的試驗設(shè)計，主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，最終解決了這場紛爭。變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück依據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，設(shè)計了左方的試驗。1.變量試驗fluctuationtest2.涂布試驗

原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。涂布試驗中突變率的計算初始接種量：5×104個/皿培育5小時，繁殖了12.3代，每個微菌落約含5100個細菌這時，每個平皿上的細胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個/皿在6個平板上，比接種時增加的細胞數(shù)為： 6×（2.6×1085×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)覺28個突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×1083.平板影印培育試驗（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦的論文《平板影印培育法和細菌突變株的間接選擇》，更好地證明白微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應(yīng)藥物環(huán)境毫不相干。平板影印培育法，是一種能達到在一系列培育皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種培育方法：把長有很多菌落的母種培育皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱印章上，使其沾上來自平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培育基平板上。待這些平板培育后，對各平板相同位置上的菌落作對比后，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途辍?jù)報道，用此法可把母平板上10-20%量的細菌轉(zhuǎn)移到絲絨布上，并可利用這一“印章”接種8個子培育皿。因此，通過影印培育法，就可以從在非選擇性條件下生長的細菌群體中，分別出各種類型的突變株。平板影印培育法在根本未接觸過任何一點鏈霉素的狀況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明白突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。平板影印培育不僅在微生物遺傳理論的探討中有重要應(yīng)用，而且在育種時間和其它探討中均有應(yīng)用，值得很好地領(lǐng)悟。（五）基因突變的機制基因突變的緣由是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點突變和畸變。具體類型可歸納如下：1.誘變機制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。依據(jù)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變更的特點探討幾種有代表性的誘變劑的作用機制。（1）堿基置換（substitution）定義：對DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點突變（pointmutation）。它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。對某一具體誘變劑來說，即可同時引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。依據(jù)化學(xué)誘變劑是干脆還是間接地引起置換，可把置換的機制分成以下兩類來探討。堿基置換突變

一個堿基被另一堿基取代而造成的突變稱為堿基置換突變轉(zhuǎn)換（transition）

顛換（transversion）

：嘌呤→嘌呤，嘧啶→嘧啶：嘌呤→嘧啶，嘧啶→嘌呤TGCA類型突變的效應(yīng)

1、同義突變（same-senseorsynonymoumutation）:堿基的變更并未引起編碼的氨基酸變更。例如，CCA→脯氨酸，當(dāng)A→G后，CCG→脯氨酸。2、錯義突變（missensemutation）:堿基的變更引起編碼的氨基酸變更。例如，GAG→谷氨酸，A→T，GUG→纈氨酸。3、無義突變（non-sensemutation）:堿基的變更使該三聯(lián)體不再構(gòu)成任何氨基酸的密碼子，而形成終止信號。例如：TAC→酪氨酸，C→A，TAA→mRNA→UAA→終止信號?！锔纱嘁鹬脫Q的誘變劑定義：一類可干脆與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，不論在機體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：很多。例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而引起DNA復(fù)制時堿基配對的轉(zhuǎn)換，并進一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起G┇C→A:T，其余都是可使G┇C=A:T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有（參見下表）。若干誘變劑的作用機制及誘變功能誘變因素 在DNA上的初級效應(yīng) 遺傳效應(yīng)堿基類似物 摻入作用 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換羥胺 與胞嘧啶起反應(yīng) GC→AT的轉(zhuǎn)換亞硝酸 A、G、C的氧化脫氨作用 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換交聯(lián) 缺失 烷化劑 烷化堿基（主要是G） AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 烷化磷酸基團 AT→TA的顛換 丟失烷化的嘌呤 GC→CG的顛換 糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 丫啶類 堿基之間的相互作用（雙鏈變形） 碼組移動（＋或－） 紫外線 形成嘧啶的水合物 GC→AT轉(zhuǎn)換 形成嘧啶的二聚體碼組移動（＋或－） 交聯(lián) 電離輻射 堿基的羥基化核降解 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換DNA降解 碼組移動（＋或－） 糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位）丟失嘌呤

加熱 C脫氨基 CG→TA轉(zhuǎn)換Mu噬菌體 結(jié)合到一個基因中間 碼組移動 亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黃嘌呤（H）HNO2鳥嘌呤（G）黃嘌呤（X）這些反應(yīng)及形成物均可在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉(zhuǎn)換。堿基轉(zhuǎn)換的分子機制——以亞硝酸為例

腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤（H）后引起的轉(zhuǎn)換過程：①腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤（He）②He通過互變異構(gòu)效應(yīng)形成酮式次黃嘌呤（HK）③DNA復(fù)制時，HK與胞嘧啶（C）配對④DNA其次次復(fù)制時，C與G正常配對，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)換。亞硝酸引起的AT-GC轉(zhuǎn)換細微環(huán)節(jié)這類誘變劑主要是一些堿基類似物

,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等等；

作用方式：通過活細胞的代謝活動參入到DNA分子中，主要是在DNA復(fù)制時堿基類似物插入DNA中，引起堿基對配對錯誤，造成堿基置換。以5-溴尿嘧啶(5-BU)為例：

5-BU是胸腺嘧啶（T）的的類似物，酮式的5-BU可以和A配對，烯醇式的5-BU可以和G配對，在DNA分子復(fù)制的過程中，由于5-BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換?！镩g接引起置換的誘變劑5-BU引起的轉(zhuǎn)換5-BU引起的轉(zhuǎn)換從上圖中，還可以看到5-BU的摻入引起的G┇C回復(fù)到A?T的過程。通過這兩個圖示，就很簡潔理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產(chǎn)生回復(fù)突變的緣由了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對正在進行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。（2）移碼突變frame-shiftmutation或phase-shiftmutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shiftmutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。圖8-14——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個嘌呤—嘧啶對特別相像。丫啶類化合物的誘變機制：至今還不很清晰。有人認為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個嘌呤–嘧啶對特別相像，故能嵌入兩個相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個堿基對原來相距0.34nm，當(dāng)嵌入一個丫啶分子時，就變成0.68nm），從而在DNA復(fù)制過程中，會使鏈上增加或缺失一個堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：（3）染色體畸變（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點突變外，還會引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：染色體結(jié)構(gòu)上的變更：缺失（deletion）重復(fù)（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變更★染色體結(jié)構(gòu)上的變更分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類。染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變更，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時，其結(jié)果可造成基因的削減或增加；如發(fā)生倒位或易位時，則可造成基因排列依次的變更，但數(shù)目卻不變更。倒位--------是指斷裂下來的一段染色體旋轉(zhuǎn)180后，重新插入到原來染色體的原位置上，從而使其基因依次與其它的基因依次相反；易位--------是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。染色體畸變轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement）由40年頭B.McClintock對的遺傳探討而發(fā)覺染色體易位，自1967年以來，已在微生物和其它生物中得到普遍證明，并已成為分子遺傳學(xué)探討中的一個熱點。舊概念：基因是固定在染色體DNA上的一些不行移動的核苷酸片段。新發(fā)覺：有些DNA片段不但可在染色體上移動，還可從一個染色體跳到另一個染色體，從一個質(zhì)粒跳到另一個質(zhì)?；蛉旧w，甚至還從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在這些DNA依次的跳動過程中，往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement）：在染色體組中或染色體組間能變更自身位置的一段DNA依次。也稱作跳動基因（jumpinggene）或可移動基因（movablegene）。轉(zhuǎn)座因子的種類（1）插入序列（IS，insertionsequence）：特點是分子量最?。▋H0.7－1.4kb），只能引起轉(zhuǎn)座（transposition）效應(yīng)而不含其它基因?？梢栽谌旧w、F因子等質(zhì)粒上發(fā)覺它們。已知的IS有5種，即IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E.coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通過這些同源序列間的重組，就可使F因子插入到E.coli的核染色體組上，從而使后者成為Hfr菌株。因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應(yīng)也不同。IS引起的突變可以回復(fù)，其緣由可能是IS被切離，假如因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會在插入部位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。轉(zhuǎn)座因子的種類（2）轉(zhuǎn)座子（Tn，transposon，又稱轉(zhuǎn)位子，易位子）：IS和Mu噬菌體相比，Tn的分子量是居中的（一般為2－25kb）。它含有幾個至十幾個基因，其中除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外，還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其它基因。Tn雖能插到受體DNA分子的很多位點上，但這些位點似乎也不完全是隨機的，其中某些區(qū)域更易插入。轉(zhuǎn)座因子的種類（3）Mu噬菌體（即mutatorphage，誘變噬菌體）：它是E.coli的一種溫順噬菌體。與必需整合到宿主染色體特定位置上的一般溫順噬菌體不同，Mu噬菌體并沒有確定的整合位置。與以上的IS和Tn兩種轉(zhuǎn)座因子相比，Mu噬菌體的分子量最大（37kb），它含有20多個基因。Mu噬菌體引起的轉(zhuǎn)座可以引起插入突變，其中約有2%是養(yǎng)分缺陷型突變。2.自發(fā)突變機制自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。幾種自發(fā)突變的可能機制★微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)：過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。它對Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低，假如在加入該酶的同時又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中一種內(nèi)源性誘變劑。在很多微生物的陳舊培育物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的緣由?！锘プ儺悩?gòu)效應(yīng)：堿基T、G的第六位上是酮基，會以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)C、A的第六位上是氨基，會以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)平衡一般趨向于酮式或氨基式，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以A︰T和G┇C堿基配對的形式出現(xiàn)在偶然狀況下，在DNA復(fù)制到達這一位置的瞬間，在T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時，其相對位置上就出現(xiàn)G同樣，假如C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復(fù)制到達這一位置的瞬間，則在新合成DNA單鏈中與C相對應(yīng)的位置上就將是A。這可能就是發(fā)生相應(yīng)的自發(fā)突變的緣由。要預(yù)言在某一時間、某一基因發(fā)生自發(fā)突變是不行能的。在運用數(shù)學(xué)方法對這些偶然事務(wù)做大量統(tǒng)計分析后，可以發(fā)覺并駕馭其中的規(guī)律。例如，據(jù)統(tǒng)計，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10–8-10–9。★環(huán)出效應(yīng)：即環(huán)狀突出效應(yīng)。有人提出，在DNA的復(fù)制過程中，假如其中某一單鏈上偶然產(chǎn)生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。下圖就是環(huán)出效應(yīng)的設(shè)想機制。在上鏈中，標(biāo)記B處發(fā)生“環(huán)出”，故只有A及C能獲得復(fù)制，從而發(fā)生自發(fā)突變。而在下鏈中，復(fù)制仍正常進行（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)已知的DNA損傷類型很多，機體對其修復(fù)的方式也各異。發(fā)覺較早和探討得較深化的是紫外線（U.V.，ultravioletray）的作用。嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清晰的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消退。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。在互補雙鏈間形成嘧啶二聚體的機會較少。但一旦形成，就會阻礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細胞死亡。光復(fù)活作用（photoreactivation）定義：經(jīng)紫外線照射后的微生物馬上暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)覺的。后來，在很多微生物中都得到了證明。最明顯的是在E.coli的試驗中：比照：8×106個/mlE.coliU.V. 100個/mlE.coli試驗：8×106個/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個/mlE.coli可見光，30分經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶（photoreactivatingenzyme）即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時，光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細胞中約含有25個光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。圖:光復(fù)活作用暗修復(fù)作用（darkrepair）又稱切除修復(fù)（excisionrepair）。是活細胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。這種修復(fù)作用與光無關(guān)。有四種酶參與——①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側(cè)切開一個3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起逐個延長，重新合成一段缺失的DNA鏈；④通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端與原鏈的5’-P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。暗修復(fù)作用（darkrepair）1、由核酸內(nèi)切酶切開二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。紫外誘變方法:設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253、7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm—30cm樣品：要干脆暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時間、菌液濃度、菌液厚度、細胞本身特性等因素有關(guān)，所以單純用時辰表示照射劑量并不完全牢靠。確定的死亡率必定對應(yīng)確定的照射劑量，所以，在實際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更牢靠。通常先繪制照射時間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。生產(chǎn)上常常接受的劑量：死亡率為70%——80%左右。重組修復(fù)：必需在DNA復(fù)制的狀況下進行，所以又叫復(fù)制后修復(fù)。細胞在不切除二聚體的狀況下，以帶有二聚體的這條鏈為模板合成互補單鏈，但在每個二聚體旁邊留有一空隙。通過染色體交換，空隙部位就不在面對著胸腺嘧啶二聚體，而是面對著正常的單鏈，在這種條件下，DNA聚合酶和連接酶起作用將空隙部位進行修復(fù)，重組修復(fù)中的DNA損傷并沒有去除，但隨著微生物的傳代繁殖，損傷的比例漸漸降低。誘變育種：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變更，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。是用物理或化學(xué)的誘變使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變更，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。誘變育種具有極其重要的實踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所運用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。（七）誘變育種（一）自發(fā)突變與育種1.從生產(chǎn)中選育剛好選擇出正變菌株如：宇佐美曲霉3758號菌株2.定向培育優(yōu)良菌株定向培育：利用微生物的自發(fā)突變，并接受特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良的古老方法。如：卡介苗（BCGvaccine）

（二）誘變育種的步驟：原始菌種純化斜面/肉湯培育單孢子/單細胞懸液誘變劑處理平板分別移至斜面小試中試初篩復(fù)篩計算存活率視察形態(tài)變異，挑單菌落良種保藏原菌種特性鑒定誘變育種的基本過程：選擇選擇合適的動身菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴大試驗誘變育種中的幾個原則：(1)選擇簡便有效的誘變劑(2)選擇優(yōu)良的動身菌株(3)處理單細胞或單孢子懸液(4)選用最適的誘變劑量(5)充分利用復(fù)合誘變的協(xié)同效應(yīng)(6)利用和創(chuàng)建形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)(7)設(shè)計高效的篩選方案(8)創(chuàng)建新型篩選方法1.動身菌株的選擇：

動身菌株———用來育種處理的起始菌株

◆動身菌株應(yīng)具備：

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的實力或潛力；

◆動身菌株的來源；

①自然界干脆分別到的野生型菌株：

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株：

③已經(jīng)驗多次育種處理的菌株：2.制備細胞懸液

要求：

①菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生長；

②細胞分散且為單細胞，以避開表型拖延現(xiàn)象（phenotypiclag）;

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度：

細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml表型拖延現(xiàn)象:指某一突變在DNA復(fù)制和細胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。產(chǎn)生緣由：①分別性拖延現(xiàn)象②生理性拖延現(xiàn)象3.誘變處理：誘變劑的作用：①提高突變的頻率②擴大產(chǎn)量變異的幅度③使產(chǎn)量變異朝著正突變或負突變移動劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量?！滤缆适亲詈玫恼T變劑相對劑量的表示方法。最適劑量的選擇：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70-80%）選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應(yīng)選用最便利的因素；而在同樣便利的狀況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最便利，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。簡便有效的誘變方法：紫外線的照射最為便利?；瘜W(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反映的方法很多，實際工作時可參看有關(guān)書籍。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上動身菌株細胞，然后在平板上勻整地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培育后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出很多單菌落，最終可用影印培育法或逐個檢出法選出突變種?！锶毕菪偷膽?yīng)用作為菌株的遺傳標(biāo)記：進行基因工程、誘變育種、探討代謝過程時用作親本標(biāo)記；作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；作為aa、維生素、堿基的測定菌株。Amestest：對化學(xué)誘變劑做檢測菌種：鼠傷寒沙門氏菌his-；原理：his-在基本培育基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長。Amestest方法示意圖誘變處理方式：

單一因子處理：復(fù)合因子處理：兩種以上因素協(xié)同效應(yīng)先后使用同時使用單一因子重復(fù)使用實行土壤樣品要考慮的幾個問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特殊肥沃的土壤中細菌多，放線菌少；在植物殘體枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。離地面5－20cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，喊菌量最高。采土季節(jié)以春秋兩季最好。采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準備的無菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點、植被狀況等。多點采土、混合分別，可以代表每一地塊上的微生物分布平均狀況4.菌種篩選土樣的富集培育含有目的菌較多的土樣不須要富集培育假如原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培育使之以較其它微生物更快的速度生長繁殖，從而提高它們在樣品中的比例，便于分別。富集培育的一般方法：接受有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的養(yǎng)分和培育條件，以達到使目的菌種在群體中比例上升的目的。一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生實力的菌種，不簡潔富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。某些細菌的富集條件富集對象 接種菌樣添加養(yǎng)分物(g) 特殊培育條件好氧氨基酸氧化菌 土壤 – 好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌 土壤，巴氏消毒 – 好氧，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌 土壤，巴氏消毒 – 厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6厭氧八疊球菌 土壤 葡萄糖20 厭氧，pH2~3乳酸菌 植物體或牛奶 葡萄糖20 厭氧，pH6.5腸道細菌 土壤或污水 葡萄糖20，CaCO320 好氧或厭氧，pH7.0丙酸菌 干酪 乳酸鈉20 厭氧，pH7.0醋酸菌 果實或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培育基成分為酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培育在30℃下。1.“投其所好”或抑制選擇2.選擇性理化因素溫度、氧、pH和滲透壓等。纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基纖維素粉5gNaNO31gNa2HPO4·7H2O0.5gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5gKCl0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容到1000ml大腸菌群：是指37℃生長時能發(fā)酵乳糖,在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌,除包括大腸埃希氏桿菌屬外,還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬。4.1篩選方案：實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡潔。復(fù)篩的目的：確認符合要求的菌株；——復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.可見，設(shè)計和接受效率高的篩選方案和方法極其重要。以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下：第一輪：一個出發(fā)菌株→→→選出200個菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）第二輪：5個出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復(fù)篩（每瓶一株）（每瓶四株）誘變處理4.2變異菌的一般篩選方法4.2.1平皿快速檢測法變色圈法透亮圈法生長圈法抑菌圈法梯度平板法4.2.2搖瓶培育法用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株羧甲基纖維素鈉作培育物抗生素篩選檢定菌培育，加上發(fā)酵液以溫度敏感突變?yōu)槔汉Y選方法：用途：常用于提高代謝物產(chǎn)量緣由：是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)變更后，在高溫下活力丟失重要性：假如此酶為蛋白質(zhì)、核酸合成途徑中所需的酶，則此變異株在高溫下的表型就是養(yǎng)分缺陷型。4.3.1條件抗性突變型的篩選4.3特殊變異菌的篩選方法：舉例：由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256，經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株Ts88:30℃培育時能正常生長40℃是死亡，但能在富含生物素的培育基中積累谷氨酸（而野生型卻受生物素的反饋抑制）。在富含生物素的培育基中進行發(fā)酵時：先在30℃（允許條件）中進行培育以得到大量菌細胞，適當(dāng)時間后提高溫度（40℃，非允許條件），即能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。方法：梯度平板法（gradientplate）4.3.2抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應(yīng)用：作為菌株的遺傳標(biāo)記作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株）4.3.3抗生素抗性變異株的篩選：★與養(yǎng)分缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體：養(yǎng)分缺陷型：經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成實力出現(xiàn)缺陷，而必需在培育基內(nèi)加入相應(yīng)有機養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。如：lys-，bio-野生型：自然界分別到的任何微生物，在其發(fā)生養(yǎng)分缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。如：lys+;bio+;原養(yǎng)型：指養(yǎng)分缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。4.3.4養(yǎng)分缺陷型(auxotroph)的篩選★與篩選養(yǎng)分缺陷型突變株有關(guān)的三類培育基基本培育基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株養(yǎng)分要求的最低成分的合成培育基。完全培育基（CM）[+]：滿足一切養(yǎng)分缺陷型菌株生長的自然或半合成培育基。補充培育基（SM）[x]：在MM中有針對性地加入一或幾種養(yǎng)分成分以滿足相應(yīng)養(yǎng)分缺陷型菌株生長的合成培育基?！镳B(yǎng)分缺陷型誘變篩選步驟及方法auxo的鑒定

誘變處理auxo的濃縮auxo的檢出缺陷型的濃縮：①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細胞，對休止態(tài)細胞無作用。方法：將菌培育在含抗生素的MM基中②菌絲過濾法適用于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培育基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。①逐個檢出法：缺陷型的檢出：②影印平板培育法③夾層培育法①生長譜法方法簡便；回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片

缺陷型的鑒定：測定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型；其次節(jié)段：依據(jù)第一階段確定的范圍，進一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；組合養(yǎng)分物法：步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a.將多種養(yǎng)分因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培育基上培育；c.結(jié)果分析；如：一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：48111314

五組：59121415養(yǎng)分因子分組編排時留意；1）每組內(nèi)無重復(fù)的營養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng)分別出現(xiàn)二次

一組：1

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二組：26

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三組：3710

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五組：59121415②組合補充培養(yǎng)基法：將待測的菌點種到各種補充培養(yǎng)基上，逐個分析各菌的缺陷類型，或快速分離出所需缺陷類型的菌株。ABFEDCHG第三節(jié)基因重組定義：凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的狀況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。重組與雜交的關(guān)系：重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交。而一般所說的雜交（hybridization）則是細胞水平上的一個概念。雜交中必定包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。真核微生物中的有性雜交、準性雜交（parasexualhybridization）等及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細胞水平上的反映。微生物中各種形式基因重組的比較 重組范圍 整套染色體 局部雜合供體和受體的關(guān)系 高頻率 低頻率部分染色體個別或少數(shù)基因細胞融合 性細胞真菌的有性生殖 或聯(lián)結(jié) 體細胞 真菌的準性生殖 細胞間短暫溝通 細菌的接合 性導(dǎo) 細胞間 吸取游離DNA片段 轉(zhuǎn)化不接觸 噬菌體攜帶DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 完整噬菌體 溶源轉(zhuǎn)變供應(yīng)遺 噬菌體DNA 轉(zhuǎn)染 傳物質(zhì)基因重組的意義基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。雜交育種的優(yōu)點：①由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進了一大步。②利用雜交育種往往還可以消退某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。雜交育種的缺點：由于雜交育種的方法較困難，工作進展較慢，還很難像誘變育種技術(shù)那樣得到普遍的推廣和運用，尤其在原核生物的領(lǐng)域中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見。到了70年頭后期，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。

甲

生長快、產(chǎn)量低乙生長慢、產(chǎn)量高基因重組如：生長快、產(chǎn)量高一、原核微生物的基因重組基因重組的方式轉(zhuǎn)化（吸取游離DNA片段）轉(zhuǎn)導(dǎo)（噬菌體攜帶DNA）接合（細胞間短暫溝通）原生質(zhì)體融合（人工細胞融合）ConjugationTransformationTransduction定義：受體菌自然或在人工技術(shù)作用下干脆攝取來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。有關(guān)名詞：受體菌：recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者供體菌：donor，轉(zhuǎn)化基因的供應(yīng)者轉(zhuǎn)化因子：來自供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)化子：transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進入自身染色體組的重組子（一）轉(zhuǎn)化（transformation）1、轉(zhuǎn)化及其發(fā)覺：R型活菌+S型死菌→→S型活菌1.轉(zhuǎn)化供體菌裂解游離的DNA片段被受體菌干脆攝取，使受體菌獲得新的性狀①受體細胞要處于感受態(tài).感受態(tài)：competence，受體細胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)②供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1×107D左右③菌株間的親緣關(guān)系親密2、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件：3、轉(zhuǎn)化的類型：依據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：①自然遺傳轉(zhuǎn)化naturalgenetictransformation②人工轉(zhuǎn)化artificialtransformation

感受態(tài)：出現(xiàn)時間：只在細菌生長的某一時期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長時期。Streptococcuspneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長曲線中的指數(shù)期的中期，Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。感受態(tài)由細胞