口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)進展：5 共聚焦顯微鏡和流式細胞技術(shù)

共聚焦顯微鏡和流式細胞技術(shù)2015研究生課程激光掃描共焦顯微鏡FruitFlyEmbryoNervousSystem主要內(nèi)容一、共聚焦顯微鏡快速入門(結(jié)構(gòu)和原理簡介)三、共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡比較五、本實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)參數(shù)二、共聚焦顯微鏡功能及應(yīng)用范圍：四、共聚焦顯微鏡樣本處理和實驗前須知：共聚焦成像原理點成像—針孔—最靈魂的部件位于共軛焦平面的小孔（共聚焦針孔），阻擋了來自焦平面以外的信號共聚焦針孔的直徑直接控制了光學(xué)切片的厚度樣品主分色鏡檢測器共聚焦針孔一、共聚焦顯微鏡快速入門(結(jié)構(gòu)和原理簡介)1水銀弧光燈2中密度濾片3光鑭4場鑭5激發(fā)濾片6分光鏡（BSP)7物鏡8樣品9,10發(fā)射濾片11目鏡常規(guī)熒光顯微鏡ObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilter常規(guī)熒光顯微鏡照明針孔探測針孔二色鏡或分光鏡激光光源共聚焦熒光顯微鏡常規(guī)熒光顯微鏡與共聚焦熒光顯微鏡比較針孔針孔阻擋了其它方向的雜光，使采集到的圖像局限于某一焦平面關(guān)鍵點二、共聚焦顯微鏡功能及應(yīng)用范圍：激光做光源，光色純，波長固定，成像效果好，分辨率高，圖象清晰，熒光檢測信噪比高可實現(xiàn)分層掃描可實現(xiàn)連續(xù)掃描，可動態(tài)記錄變化可多根激光管同時掃描，多色熒光同時成像掃描速度快，對樣品損傷小——結(jié)構(gòu)方面激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢ConventionalfluorescencemicroscopeConfocalmicroscope——功能方面激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢形態(tài)觀察--高清晰成像半定量--熒光強度分析熒光探針表達量測定定位研究--分層掃描多種熒光標記同時檢測熒光標記物絕對定量分析擴展應(yīng)用---如細胞切割、細胞篩選等細胞“CT”片細菌生物膜斷層——效果方面激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢更靈敏：

共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù)，可將很微弱的熒光信號放大。只要有信號就能被檢測到。

定位更精確：

不僅可以定位到細胞水平，還可以定位到亞細胞水平、和分子水平。這也是熒光標記的抗體被稱為分子探針的原因。細胞膜（AlexaFluor488）AlexaFluor594標記的單壁碳納米管透射光通道重疊圖像Hela細胞內(nèi)化碳納米管過程12hat37°C藤黃微球菌綠色：活菌紅色：死菌染色：LIVE/DEADBacLightBacterialViabilityKit變形鏈球菌綠色：活菌紅色：死菌染色：LIVE/DEADBacLightBacterialViabilityKit變形鏈球菌綠色：活菌紅色：死菌染色：LIVE/DEADBacLightBacterialViabilityKit變形鏈球菌綠色：活菌紅色：死菌染色：LIVE/DEADBacLightBacterialViabilityKit熒光多標記同時進行熒光多標記（物質(zhì)共存、空間關(guān)系定位等）motornerve-Cy2musclebagfiber-Cy3

Nucleus-DAPI靜態(tài)的定量測量對于不同組的樣品，可以單純比較一種成分，也可以同時比較兩種甚至三種成分。也可以在同一張切片上比較不同成分含量。動態(tài)的定量測量共聚焦顯微鏡還能對活細胞內(nèi)的特定成分（如：鈣、鈉、氫等）進行動態(tài)變化測量，并給出動態(tài)變化曲線；還可以同時測量幾種成分，并給出含量比值?！繙y試激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢種植體周圍新骨形成細胞GFP的表達由于利用光源光束點掃描，檢測過程快，時間短，計算機精確控制激發(fā)光強度，光漂白和熒光淬滅作用很小。

數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存：

用計算機代替了普通的照相機，得到的圖像是數(shù)字化的，不存在暴光方面及膠卷沖洗方面的問題（如熒光太弱，無法暴光；或曝光過程中熒光淬滅等）；而且圖像可進一步加工處理。

——快速性激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢共聚焦顯微鏡的應(yīng)用（概述）細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細胞骨架蛋白等基因表達產(chǎn)物）、DNA、RNA等細胞膜流動性（熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）細胞內(nèi)活性氧變化細胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用定位、定量免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細胞的 增值、分化細胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI

末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-ReactiveProbes

與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等

GreenRed Fura-redFITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻紅蛋白)TexasRed595/615(德州紅)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR 592/618

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用1)細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白免役熒光標記：與抗體耦聯(lián),

直標:一抗+熒光探針間標:二抗+熒光探針如:微管蛋白tublin(抗tublin抗體+熒光探針)

肌動蛋白actin(Palloidine+熒光探針)2)細胞膜表面受體 配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)

標記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2.標記細胞器熒光探針1)線粒體Mitochondria

Rodamin123505/534，可染活細胞，陽離子,可檢測線粒體膜電位,且在多數(shù)細胞中停留時間短

JC1線粒體膜電位低時為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時為多聚體490/590發(fā)紅光可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細胞或固定細胞,

穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細胞激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2)溶酶體

Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標記溶酶體等酸性器官

為非特異性

AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細胞

LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

EndoplasmicReticulum

DiOC6484/500:非特異性,較高濃度標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),

較低濃度標記線粒體4)高爾基體

GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細胞

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用細胞器的單克隆抗體5)細胞核

PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死細胞Hochest33342352/461DNAA-T活細胞Hochest33258352/461DNAA-T活細胞DAPI358/461DNAA-T半通透細胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活細胞

560/650RNATOTO-1514/533DNA 死細胞SYTO11~1620~24488/520活細胞SYTO11~1620~24521/556活細胞SYTO17 621/634 活細胞3.GFP綠色熒光蛋白將外源基因與GFPDNA相連,GFP可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達.激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用動態(tài)測量Physiology:細胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量1).游離Ca2+測量

檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有關(guān)，如pH、Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100nM)，細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用pH值的檢測：

BCECF-AM 490nm530nm6.5-7.5Snarf-1-AM488nm580/640nm7.0-8.02',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein,acetoxymethylester自由基的檢測熒光探針：H2DCF-DA（504nm/529nm）

2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽胞外H2DCF-DA擴散入細胞內(nèi)酯酶脫乙酰DCF-H(不熒發(fā)光）DCF（發(fā)熒光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察

Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123被動擴散入細胞內(nèi)在細胞內(nèi)被氧化成rod123（發(fā)光）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布

xyzt掃描

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用

膜電位的測量標記膜電位探針(慢反應(yīng)）：JC1510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS496nm 703nmDi-4-ANEPPS498nm 713nm細胞膜靜息膜電位：-70mV線粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針

激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件：兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致1.普通顯微鏡簡單、快捷，所看到的圖像是樣本的全部結(jié)構(gòu)。三、共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡比較2.共聚焦顯微鏡看到的只是樣本熒光的信號，而且僅僅是某一層面的結(jié)構(gòu)。即普通顯微鏡是各層平面疊加的效果，共聚焦是一種斷層掃描的效果，倒置熒光顯微鏡，Hoechst和PI雙重染色。藍色熒光的為正常細胞，淺紅色的為凋亡細胞（如箭頭所示細胞外形不規(guī)則，胞漿著色加深，細胞核固縮或碎裂，凋亡小體大小不等，有的已被鄰近的腫瘤細胞吞噬舉例凋亡共聚焦顯微鏡觀察效果不如前二者三、共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡比較3.普通光學(xué)顯微鏡，成像部分發(fā)生重疊，從而造成圖像對比度的降低。而共聚焦顯微鏡卻可以獲得對比度非常高的圖像，也提高了顯微鏡的分辨能力。4.共聚焦顯微鏡高度方向測定以及焦點深度擴張的原理，使其圖像景深很長富有立體感。普通顯微鏡共聚焦顯微鏡三、共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡比較5.共聚焦顯微鏡可實現(xiàn)實時觀測。6.共聚焦顯微鏡可實現(xiàn)高精度微小尺寸，并測定機能。7.共聚焦顯微鏡可獲得多維圖像，如立體三維的掃描成像.在實際應(yīng)用中盡管幾乎所有標本都采用的是熒光標記，但決不能將LSCM認為就是一種“高質(zhì)量圖像的熒光顯微鏡”.共聚焦顯微鏡并不總是熒光檢測的最好工具。激光共聚焦顯微鏡的局限和威力共聚焦顯微鏡真正的威力是依賴于其強烈抑制焦平面外熒光信號的能力，有很好的深度分辨能力或光學(xué)切片功能?；谠撔再|(zhì)的應(yīng)用包括:樣品的顯微斷層掃描(microscopicCT)Z掃描切片的3-D重建是否需要分層掃描

共聚焦

較厚層面較薄層面常規(guī)顯微鏡重疊的細胞，可看到整體3D重建的效果取決于共聚焦顯微鏡的性能和后期軟件處理SP2共聚焦顯微鏡普通廣視野熒光圖像樣品的厚度大于物鏡的焦深擴展焦深共聚焦顯微鏡獲得的樣品的光學(xué)切片光學(xué)切片的厚度取決于共聚焦針孔的直徑所有細節(jié)都來自聚焦平面四、共聚焦顯微鏡樣本處理和實驗前須知：共聚焦顯微鏡實驗前須知：1.適用于薄底培養(yǎng)皿、蓋玻片等制備的細胞或組織切片?；罴毎L時間觀察須用無菌薄底培養(yǎng)皿。2.選擇合適的熒光染料：必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)，激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)，熒光素光譜的重疊應(yīng)當盡量減少。共聚焦顯微鏡實驗前須知：3.在上共聚焦顯微鏡拍照前，最好在普通的熒光顯微鏡下事先觀察實驗的結(jié)果。原因如下：一是可以判定需不需要動用共聚焦熒光顯微鏡，信號好并且背景淺則動用，信號較弱亦可，如果沒信號，那就免了。二是可以先在普通熒光顯微鏡下找到理想的細胞或者組織所在的區(qū)域，并用記號筆在這區(qū)域旁點一下，以作標記，然后再上共聚焦顯微鏡，此時可以直接上高倍油鏡，鏡頭對準已經(jīng)作了標記的區(qū)域，鏡下稍微微調(diào)焦距即可找到你要的理想的細胞信號，立即拍照即可得到理想的圖片。防止熒光信號淬滅。共聚焦顯微鏡實驗前須知：4.激光共聚焦離體細胞的比較容易做出來，背景自發(fā)熒光少，離體細胞容易染色。但是組織切片就不那么容易做了，一定要用冰凍切片做，不要用石蠟切片做。因為石蠟切片比較薄，樣品在做的過程中容易碎裂，更重要的就是石蠟切片自發(fā)熒光很高，背景也會染上很強的熒光，所以結(jié)果總是不理想；做的過程中一定要做一個空白對照，即不加一抗、二抗的空白對照。共聚焦顯微鏡實驗前須知：5.實驗之前必須對實驗圖像結(jié)果有準確的預(yù)想，一定要做到心中有數(shù)?？匡@微鏡形態(tài)學(xué)的實驗去發(fā)現(xiàn)新東西是不可能的，只能是印證預(yù)想的結(jié)果，及結(jié)果的形態(tài)化和量化。6.數(shù)據(jù)只能用光盤（非可擦寫光盤，是CD，不是DVD）刻錄，刻錄數(shù)據(jù)應(yīng)由本實驗室工作人員操作，嚴禁用移動硬盤、u盤等從電腦上拷貝數(shù)據(jù)（出于系統(tǒng)安全考慮）。五、本實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)參數(shù)儀器設(shè)備名稱及型號：激光掃描共聚焦顯微鏡LEICATCSSP2儀器設(shè)備英文名稱及型號：LaserScanningConfocalMicroscopeLEICATCSSP2產(chǎn)地及廠家：德國LEICA公司2004年9月購入五、本實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)參數(shù)主要技術(shù)指標：目前使用405nm、488nm、543nm、594nm、633nm四種波長激光發(fā)生器；倒置熒光顯微鏡擁有10x，20x，40x，63x油鏡。目前，594nm、633nm檢測效果不好。五、本實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)參數(shù)配置顯微鏡LeicaDMRE熒光顯微鏡的技術(shù)指標BF:明場，brightfield，可見光全波段WU：紫外，<430nm的激發(fā)波長WB：藍光，430-500nmWG：綠光，500-560nm五、本實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)參數(shù)功能及應(yīng)用范圍：1、原位鑒定細胞或組織內(nèi)生物大分子,觀察細胞及亞細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。①在細胞原位檢測核酸②原位檢測蛋白質(zhì),抗體及其他分子③檢測細胞凋亡④細胞器觀察及測定⑤檢測細胞融合⑥觀察細胞骨架⑧檢測細胞內(nèi)脂肪。五、本實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)參數(shù)2、活體細胞或組織功能的實時動態(tài)監(jiān)測①實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變化②測定細胞內(nèi)PH變化③檢測膜電位的變化④檢測細胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生⑤檢測藥物等跨膜進入組織或細胞過程及其定位⑥檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)⑦檢測熒光漂白恢復(fù)(FRAP)，⑧三維圖像重建。流式細胞術(shù)

FlowCytometry（FCM）主要內(nèi)容一、流式細胞術(shù)快速入門(結(jié)構(gòu)和原理簡介)四、凋亡結(jié)果圖解讀六、本實驗室流式細胞儀技術(shù)參數(shù)三、流式細胞周期結(jié)果圖解讀五、流式細胞術(shù)樣本處理和實驗前須知二、流式細胞術(shù)的主要應(yīng)用一、流式細胞術(shù)快速入門(結(jié)構(gòu)和原理簡介)細胞組學(xué)研究的過去、現(xiàn)在和未來暗視野光鏡，相差顯微鏡，微分干涉對比顯微鏡，偏振光顯微鏡，熒光顯微鏡單光子共聚焦顯微鏡，多光子共聚焦顯微鏡大體熒光成像系統(tǒng)細胞計數(shù)儀18世紀，明視野顯微鏡發(fā)明流式細胞儀分光高度計，熒光高度計，干涉光高度計放射自顯影細胞成像定量分析系統(tǒng)???目標細胞分選流式細胞儀與熒光顯微鏡類比熒光顯微鏡流式細胞儀視野,靜止,同時單個,流動,依次肉眼/CCDPMT多激發(fā)同時多激發(fā)(激光)流式細胞儀的功能特點概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是一種利用流式細胞儀對生物細胞的理化特性和生物學(xué)特性進行多參數(shù)定量分析，和對特定細胞群體分選的技術(shù)。流式細胞儀集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細胞儀的特點單個細胞或微粒分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細胞(微粒)/秒統(tǒng)計學(xué)意義：提供細胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細胞或微粒外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖流式結(jié)果顯微鏡結(jié)果流路(液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計（分析系統(tǒng)）計算機構(gòu)造及工作原理

流動室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。液流系統(tǒng)激光光源：目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細胞快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1μs左右，每個細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細胞需要足夠的光照強度。

光學(xué)系統(tǒng)電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。細胞DNA含量、RNA含量等的測量一般選用線性放大測量。在細胞膜表面抗原等的檢測時，細胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍，通常使用對數(shù)放大器。

檢測系統(tǒng)流式細胞儀工作原理圖流動室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細胞儀光路圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光學(xué)系統(tǒng)流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性電路電壓調(diào)節(jié)光電倍增管電壓volts增益Gain信號放大方式檢測系統(tǒng)常用熒光染料介紹FITC：綠色525nmPE：橙黃色575nmECD：橙紅色610nmPE－CY5：深紅色675nmPerCP：深紅色675nmPE－CY7：深紅色755nm7AAD：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)熒光信號熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。熒光染色設(shè)計的幾個原則了解儀器的激光/濾光片的組合匹配熒光亮度與最低密度的目標分子了解所用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射譜減小熒光光譜重疊使用多桿激光，但需避免多重激發(fā)小心使用組合染料（tandemdyes）設(shè)定合適的對照樣本（調(diào)節(jié)熒光補償?shù)臉颖荆晒馊旧珜φ盏脑O(shè)置陰性對照空白對照（自發(fā)熒光）同型（ISO)對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）實驗樣本（特異熒光＋自發(fā)熒光＋非特異熒光）同型對照的選擇與實驗染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型；與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度流式細胞術(shù)實驗過程

細胞懸浮液制備（濃度為1～5×106個/ml）細胞固定（合適的固定液，如4%甲醛溶液等）細胞膜穿透（

冰冷的甲醇等）封閉（3%BSA-PBS等）一抗孵育熒光二抗孵育流式細胞儀分析Gate設(shè)置：選定散點圖中的指定一個區(qū)域，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群對其參數(shù)進行分析。設(shè)門分析技術(shù)(gatinganalysis)門的形狀：線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、十字門、任意形狀門。

流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關(guān)，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細胞為偏態(tài)分布時一般用該值。散點圖

密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流式細胞圖圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞二、流式細胞術(shù)的主要應(yīng)用細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞凋亡在上述信號基礎(chǔ)上的細胞分選流式細胞術(shù)的細胞學(xué)應(yīng)用流式細胞儀的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)殘量白血病細胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病流式細胞儀的科研應(yīng)用免疫功能研究癌癥病人的多藥耐藥性細胞動力學(xué)功能研究動物性別篩選海洋與環(huán)境微生物分析染色體分選流式細胞儀的遺傳學(xué)應(yīng)用細胞DNA,RNA含量的測定染色體倍體分析染色體分離基因表達產(chǎn)物的生物活性研究基因轉(zhuǎn)染表達的生物效應(yīng)基因表達調(diào)控研究細胞內(nèi)基因定位酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選報告基因的定性定量檢測植物遺傳學(xué)研究??????一）細胞DNA含量檢測細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。

DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究

1.腫瘤診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學(xué)診斷。2.凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測原理在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進行熒光素（FITC、PE）或Biotin標記，以標記了的AnnexinV-FITC作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡中晚期的細胞和死細胞，碘化丙啶PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將細胞凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。AnnexinVAssay

熒光補償示意圖圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死CD3(T細胞，CD4、CD8))、CD19（B細胞）、CD16、CD56（NK細胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。

三）淋巴細胞分類流式細胞術(shù)檢測細胞表型

流式細胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復(fù)性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。

四）白血病的免疫分型

五）細胞內(nèi)蛋白的分析：

細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光探針多為FITC。

六）細胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。

七）.分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector三、流式細胞周期結(jié)果圖解讀經(jīng)軟件處理后的報告

1、縱坐標CellNumber：即計數(shù)的有效細胞數(shù)；

2、橫坐標DNAContent：即DNA含量；DipG1-53.84%at55.56，即G1期DNA含量平均值為55.56；53.84%即G1期細胞數(shù)占總數(shù)的53.84%；DipG2-5.64%at107.72，即G2期DNA含量平均值為107.72，5.64%即G2期細胞數(shù)占總數(shù)的5.64%；DipS40.52%,即S期細胞數(shù)占總數(shù)的40.52%；G2/G1(G2期與G1期細胞比值)1.94%,即G2/G1期細胞數(shù)占總數(shù)的1.94%；CV4.30變異系數(shù)1、流式細胞周期結(jié)果圖的意義，主要從細胞周期的角度看各參數(shù)的意義：細胞周期指由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間。流式細胞結(jié)果圖各參數(shù)的意義：常用的流式細胞術(shù)分析細胞周期的方法是依據(jù)細胞DNA含量（橫坐標）來分析的：

G1/G0期：DNA復(fù)制還沒開始，也是DNA含量最少的，即流式檢測結(jié)果圖的第一個峰；

S期：DNA開始復(fù)制，到完成復(fù)制，是一個一倍DNA到二倍DNA的過程，在流式結(jié)果圖中顯示期跨度特別大（第二個不高但很寬的峰）；

G2期：DNA復(fù)制完成至分裂的一段時間，此時細胞內(nèi)含二倍DNA，在流式結(jié)果圖中的第三個峰；

M期：細胞分裂過程，此時細胞內(nèi)也是二倍DNA，用DNA含量的方法是無法與G2期分開，所以有第三峰明顯升高時報告：G2/M期阻滯。2.由于我們研究生所做的實驗一般都不是未知的臨床診斷細胞，主要是判斷對細胞周期的影響。未知細胞要計算增殖指數(shù)等，即在DNA倍體檢測實驗中，每個循環(huán)周期中S和G2/M期的細胞和G0/G1期細胞的比值就是所謂的SPF。所以，對周期的影響的判斷，主要是依據(jù)G1期、S期、G2期和M期，由于無法與G2期分開，所以稱G2/M期，三個時段的細胞比例數(shù)比較。每次實驗做好對照，陰性對照，陽性對照更重要。3.各期的意義分析G1/G0期：DNA合成前期（RNA和蛋白質(zhì)合成)，分析是否DNA損傷？外環(huán)境適宜？體積足夠？G1期是否有G1期阻滯可以用G0/1期細胞占G0/1期、S期和G2/M期之和的比例來分析，不要將凋亡細胞計算在內(nèi)。阻滯于G1期這個問題復(fù)雜，得看是真正地停留在G1期這樣會引起細胞凋亡，如果只是G1期的時間變長，那么就是真正意義上的增殖減慢。Ｇ１期阻滯是細胞對ＤＮＡ損傷作出的一種保護性反應(yīng)，它與ｐ５３基因狀態(tài)密切相關(guān)S期：DNA合成期(DNA復(fù)制、組蛋白和非組蛋白合成），DNA復(fù)制完成？s期的阻滯可由幾方面原因引起：一方面由于GI／S轉(zhuǎn)換加快，如c—Myc，c-jun，c-fos等轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)，或由于細胞周期素及細胞周期素依賴性激酶的變化等，從而使更多的細胞進入S期；另一方面進入分裂期細胞減少。像DNA復(fù)制不完全和DNA損傷修復(fù)等，使得大多細胞不能正常進入分裂期而停滯于s期。G2/M期：分裂前期（微絲、微管蛋白，成熟因子等合成）期：分裂期，DNA損傷？體積足夠？G2/M期增多：促進細胞分化？細胞阻滯在G2/M期有三種可能,一種是有絲分裂紡錘體組裝檢驗點激活,從而導(dǎo)致細胞被阻滯在有絲分裂的中期；一種是G2/Mcheckpoint激活,導(dǎo)致細胞被阻滯在G2期，而不能進入有絲分裂期；還有一種可能性在某些細胞中發(fā)生，就是細胞周期被阻滯在有絲分裂前期。G2/M期細胞增多并不能說明細胞是增殖了還是凋亡了，是細胞增殖旺盛，有的則說是細胞被阻滯于G2/M期。4.結(jié)果的影響因素阻滯細胞于G1期多伴有引起G1期細胞凋亡。分析周期阻滯，一般使用不導(dǎo)致大量凋亡的濃度和時間點，而且一般也是將周期和凋亡分開分析的，在一篇文章中，常通過不同濃度的實驗，或者不同時間點的實驗，來闡述周期阻滯和凋亡。以選擇一個好的收獲時間挺重要的。在對數(shù)生長期收獲的話，大約S期的能占40%，G1期的40%上下，做的時候弄個不加處理因素的對比一下，以檢測下你的干預(yù)是不是有效的，另一個有個特別大的失敗點—收獲得晚了，結(jié)果瓶里的細胞進入了平臺期，加藥組的和對照組的G1期都到了70%多，看不出區(qū)別了，所細胞很容易粘在一起。流式細胞術(shù)是一種可重復(fù)性非常好的檢測手段，但樣品處理要嚴格控制，包括細胞培養(yǎng)（處理）時間，細胞數(shù)，抗體量，染色時間等等都要保持前后一致。上機檢測時儀器參數(shù)設(shè)置也不能變，這樣才能保證重復(fù)性。四、凋亡結(jié)果圖解讀凋亡結(jié)果圖注意事項1、一般是先加FITC，因為FITC對PH比較敏感，加入PI后可能改變液體的PH，影響FITC活性。一般加入PI后10分鐘左右上機即可。2、加入干預(yù)因素處理前:是否為對數(shù)生長的細胞，制備成單細胞懸液時候消化是否成團——可影響細胞狀態(tài)和最后收集的細胞數(shù)情況。3、加入相應(yīng)的干預(yù)因素后:一般的要求是收集1×106

個細胞/每組4實驗處理過程中的上清里邊的懸浮細胞需要收集。大多數(shù)中晚期的凋亡細胞是不貼壁的，所以必須收集。要測到漂亮的凋亡峰除了與藥物本身誘導(dǎo)能力有關(guān)外，時間點的選擇也很重要。時間點如果太遲，出現(xiàn)的都將是debris產(chǎn)生的峰。1）濃度大抑制強的可以多收集幾孔，以保證每組1~2*10^6個細胞——這個可能是影響你的原因。若是處理因素對細胞的抑制太強，你一孔最后可能就收集不到多少細胞，離心后離心管底只有淡淡的一層。2）有的人強調(diào)，加上上清一起收集細胞（認為有的凋亡細胞飄起來了）5離心：4℃預(yù)冷的PBS液洗2