植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)

關(guān)于植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)第1頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)操作技術(shù)培養(yǎng)基的成分及作用培養(yǎng)基的種類與選擇培養(yǎng)基的配制方法第2頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四操作技術(shù)洗滌滅菌無菌操作培養(yǎng)容器封口物的種類及制作第3頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四滅菌

有菌的范疇：凡是暴露在（未經(jīng)處理的）空氣中的物體，曾經(jīng)接觸過自然水源的物體，至少它的表面，毫無例外都是有菌的。它的內(nèi)部在未經(jīng)證實(shí)之前，也應(yīng)該作為有菌物體來看待。無菌的范疇：經(jīng)過高溫灼燒或蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或者化學(xué)滅菌方法處理過后的物體，是無菌的。高層大氣、巖石的內(nèi)部，健康的動物和植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織內(nèi)部很可能是無菌的。強(qiáng)酸強(qiáng)堿、化學(xué)滅菌劑等表面和內(nèi)部是無菌的。無菌的世界遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于有菌的世界！第4頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四滅菌培養(yǎng)基的滅菌不耐熱的物質(zhì)將采用過濾滅菌玻璃器皿及耐熱用具等可采用干熱滅菌用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌布制品采用高壓滅菌其他植物材料的表面滅菌第5頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基的成分及作用在完善的培養(yǎng)基配方中至少應(yīng)包括下述幾個部分：大量元素微量元素鐵鹽有機(jī)成分瓊脂糖植物激素PH其它成分第6頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四大量元素植物所需要的元素，其濃度大于0.5毫摩爾/升應(yīng)該屬于大量元素大量元素包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等九種元素，他們占植物干重的百分之幾十到萬分之幾生理作用：1）參與肌體構(gòu)造；2）構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)；3）電化學(xué)方面的作用:維持離子濃度平衡，膠體穩(wěn)定，電荷平衡；4）發(fā)育方面起的作用：影響植物組織形態(tài)發(fā)生、器官形成。第7頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四微量元素植物所需要的元素，其濃度小于0.5毫摩爾/升應(yīng)該屬于微量元素。微量元素包括Fe、Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co

B和I等，通常培養(yǎng)基中添加10-7—10-5就可滿足需要生理作用：酶的催化、細(xì)胞分化和維持細(xì)胞完整機(jī)能等方面第8頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四多年的研究結(jié)果：

Cu有促進(jìn)離體根生長的作用；

Mo是合成活躍硝酸還原酶所必不可少的元素，也是固氮酶的組成部分，還有防止葉綠素受破壞的作用；

Mg、Zn、Na是酶的組成成份，也有防止葉綠素破壞的作用；

Mn與植物的呼吸作用和光合作用有關(guān)；

B與糖的運(yùn)輸、蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。第9頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四

當(dāng)缺乏某種元素時，往往會表現(xiàn)一些缺素癥：缺N：某些組織呈現(xiàn)鮮艷的花色素苷的色彩，導(dǎo)管不能形成；缺N、P、K：細(xì)胞變得肥腫而形成層組織減少；缺S：產(chǎn)生非常明顯的黃萎病；缺Fe：細(xì)胞分裂停止；缺B：細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長延緩；缺Mn或Mo：生長受影響。第10頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四鐵鹽采用硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉結(jié)合成螯合鐵配置而成作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂與生長；影響葉綠體的結(jié)構(gòu)組成與葉綠素的形成。第11頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四有機(jī)成分維生素類：植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常使用維C、維B1（鹽酸硫胺素）、維B6（鹽酸吡哆素）、維H（生物素）、葉酸和煙酸等，一般使用的濃度為0.1——10mg/l肌醇：本身沒有促進(jìn)生長的作用，但有助于活性物質(zhì)的發(fā)揮，并參與糖代謝，能使培養(yǎng)組織快速生長，對胚狀體和芽的形成有良好的影響氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白、水解乳蛋白有機(jī)添加物：椰乳、香蕉等第12頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四瓊脂一種從海藻中提取出來的凝固劑，一般使用濃度為0.6%—1%。以前使用瓊脂條，現(xiàn)在使用瓊脂粉，以色白、潔凈的為好。第13頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四糖糖的作用：a.作為C源，為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架；b.為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源；c.維持一定的滲透勢。使用最廣泛的是蔗糖和葡萄糖，一般的使用濃度為2%—4%。一般來說，以蔗糖做糖原時，離體的雙子葉植物的根生長得最好，而以葡萄糖為C源時，單子葉植物的根生長得最好。為了節(jié)省成本，一般選用食用白糖。第14頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四植物激素生長素類細(xì)胞分裂素類其它植物激素赤霉素（GA3）脫落酸（ABA）多效唑（PP333）第15頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四生長素類主要作用：誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽和不定芽的產(chǎn)生。常用的生長素類物質(zhì)：2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）、NAA（奈乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）。它們作用強(qiáng)弱順序：2，4－D>NAA>IBA>IAA第16頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞分裂素類主要作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進(jìn)側(cè)芽的生長及顯著改變其它的激素作用。常用的細(xì)胞分裂素類有：KT(激動素)、6-BA(6-芐基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2－iP（2－異戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效?。┖蚑DZ（噻重氮苯基脲）。作用的強(qiáng)弱順序：TDZ,4PU>ZT>2－iP>6-BA>KT。第17頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四PH培養(yǎng)基的PH值，直接影響離子的吸收，過酸過堿對材料的生長都不利。對大多數(shù)植物來說，滅菌之前培養(yǎng)基的PH調(diào)到5.6—6.0能達(dá)到要求。主要用KOH和HCl來調(diào)節(jié)。一般來說，當(dāng)PH值高于6時，培養(yǎng)基會變硬，低于5時瓊脂不能很好的凝固。

第18頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四其它成分活性碳硝酸銀香蕉泥、椰乳抗生素類物質(zhì)第19頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基的種類與選擇培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基選擇常用的試驗(yàn)方法第20頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基的種類第一類為含鹽量高的基本培養(yǎng)基，如MS、LS、BL、ER。第二類為硝酸鉀含量高的基本培養(yǎng)基，如B5、N6、SH。第三類是無機(jī)鹽中等含量培養(yǎng)基，如H基本培養(yǎng)基和Nitsch基本培養(yǎng)基。第四類為低鹽含量基本培養(yǎng)基，如White、WS和HE基本培養(yǎng)基。第21頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基選擇1、基本培養(yǎng)基的選擇（1）在選擇一種新的植物材料進(jìn)行組織培養(yǎng)時，為了盡快建立起再生體系，最好選擇常用的一些培養(yǎng)基，如MS培養(yǎng)基；（2）如果MS培養(yǎng)基不理想，可首先降低它的濃度；（3）其次再選擇在配料成分上與MS有顯著不同的其它培養(yǎng)基加以試用對比。第22頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基的選擇2、激素濃度和相對比例的確定

在試驗(yàn)中，首先應(yīng)參考已有的報(bào)道，看是否有用相同的植物、相同的組織或相近者做過成功或失敗的試驗(yàn)，如果有則可直接作參考；如果沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的激素選擇3－5個水平，再按隨機(jī)組合的方式建立起如下的實(shí)驗(yàn)方案。第23頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四16種激素配比實(shí)驗(yàn)方案第24頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四第25頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四常用的試驗(yàn)方法1、預(yù)備實(shí)驗(yàn)2、單因子實(shí)驗(yàn)3、多因子實(shí)驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)4、廣譜實(shí)驗(yàn)法5、逐步添加和逐步排除的實(shí)驗(yàn)方法第26頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)基成分的濃度換算體積百分比濃度重量百分比濃度摩爾濃度培養(yǎng)基母液的配制大量元素母液的配制微量元素母液的配制鐵鹽母液配制植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其他有機(jī)物質(zhì)母液的配制

第27頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基配制程序第28頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四過濾滅菌裝置第29頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四總結(jié)通過本章內(nèi)容的學(xué)習(xí)掌握組織培養(yǎng)的一般操作技術(shù)理解培養(yǎng)基的成分及作用了解培養(yǎng)基的種類與選擇第30頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四無菌操作第31頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四大量元素母液的配制大量元素母液濃度一般為原培養(yǎng)基濃度的10、20或50倍，有時也可用l00倍，倍數(shù)不宜過高，也不宜過低。有時將CaCl2·2H2O單獨(dú)配制保存，以免長期貯存發(fā)生沉淀。將全部大量元素配在一起時，為防止在混合時發(fā)生沉淀，須在各藥品充分溶解后，按表中順序混合，氯化鈣最后加入，以免與硫酸鎂形成沉淀。稱量大量元素的化合物用感量為0.01克的扭力天平即可。第32頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四微量元素母液的配制微量元素母液濃度宜為原培養(yǎng)基配方中用量的100倍。一般將微量元素分別稱量溶解，貯存在一個瓶個，但也有將KI分別配制，單獨(dú)貯存在棕色瓶中。稱量微量元素化合物宜用感量為0.0001g的電子分析天平。第33頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四鐵鹽母液配制培養(yǎng)基中的鐵鹽母液一般單獨(dú)配制目前常用的鐵鹽為硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物配制時，用感量為0.01g的扭力天平稱取第34頁，共36頁，2023年，2月20