生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用專家講座

食品中致病微生物檢測技術(shù)生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第1頁食品中致病微生物檢測技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)利用到有食品檢測方面，主要是針對一些有害微生物核酸進(jìn)行研究經(jīng)過核酸雜交和核酸合成等反應(yīng)快速檢測樣品中是否含有特定有害微生物，并深入確定其含量，其中最主要技術(shù)包含PCR技術(shù)、DNA探針技術(shù)和基因芯片技術(shù)。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第2頁1.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

（1）傳統(tǒng)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreation,PCR)是1985年誕生一項體外擴(kuò)增DNA方法，是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在條件下，依賴于DNA聚合酶酶促合成反應(yīng)，體外擴(kuò)增特異DNA片段技術(shù)。經(jīng)過對人工難以培養(yǎng)微生物對應(yīng)DNA或RNA片段擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物含量，從而快速對飼料中致病菌含量進(jìn)行檢測。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第3頁李秀娟等（年）對117株金黃色葡萄球菌nuc片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序，結(jié)果顯示所建立PCR方法能對117株金葡菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，焦磷酸測序結(jié)果一致性深入驗證了PCR擴(kuò)增結(jié)果特異性，說明該方法針對當(dāng)前所用研究菌株而言，還未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，含有較高特異性。

生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第4頁傳統(tǒng)PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些缺點(diǎn)，比如只能定性而不能定量地檢測，且在有死細(xì)菌存在情況下輕易產(chǎn)生假陽性、不能檢測致毒微生物產(chǎn)生毒素等。伴隨各項新技術(shù)出現(xiàn)以及與PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合，發(fā)展起來了一系列改進(jìn)PCR技術(shù)。當(dāng)前應(yīng)用方法主要有實時熒光定量PCR、多重PCR以及PCR聯(lián)合技術(shù)等。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第5頁實時熒光定量PCR實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進(jìn)程，最終經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量方法。該方法能夠?qū)MO進(jìn)行定量分析，當(dāng)前已被一些國家政府試驗室采取。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第6頁楊柳等（年）依據(jù)沙門氏菌fimY基因序列設(shè)計引物和探針,采取基因重組技術(shù)構(gòu)建用于沙門氏菌檢測定量標(biāo)準(zhǔn)品，成功構(gòu)建了沙門氏菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和沙門氏菌實時熒光定量PCR方法，含有很好特異性、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第7頁多重PCR多重PCR是常規(guī)PCR方法改進(jìn)，它是在同一個反應(yīng)中同時擴(kuò)增兩個或多個目標(biāo)基因序列。這種方法含有更大可靠性和適應(yīng)性，而且能降低檢測成本。徐偉等（年）針對單增李斯特菌轉(zhuǎn)錄調(diào)整子基因prfA和志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈基因ipaH設(shè)計引物，采取多重PCR對兩種致病菌進(jìn)行同時判定，提供了一個快速且特異性高同時檢測單增李斯特菌和志賀氏菌方法。

生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第8頁P(yáng)CR聯(lián)合技術(shù)傳統(tǒng)PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些缺點(diǎn)，采取一些新技術(shù)與PCR結(jié)合，對PCR技術(shù)完善和發(fā)展提供了有力支持，并應(yīng)用在致病菌檢測中。王永等（年)探討以16SrDNA保守區(qū)段為PCR擴(kuò)增對象，利用SSCP技術(shù)對致瀉大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，為食源性致病菌快速判定提供方法依據(jù)。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第9頁劉成志等（年）依據(jù)志賀氏菌ipaH基因保守序列設(shè)計特異性引物，篩選適當(dāng)DNA模板制備方法，采取快速常規(guī)PCR和定量實時PCR結(jié)合，對培養(yǎng)液中及乳飲料陽性樣品中志賀氏菌進(jìn)行檢測，建立乳飲料中快速檢測志賀氏菌有效方法。楊大偉等（年）應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)，以A型肉毒梭菌A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因設(shè)計特異性引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測，最低檢出限可到達(dá)為111ng/tube，該方法能夠快速、準(zhǔn)確檢測A型肉毒梭菌。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第10頁2.核酸探針技術(shù)依據(jù)核酸探針中核苷酸成份不一樣，可將其分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針，其中DNA探針是最慣用核酸探針。DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配正確高度準(zhǔn)確性，對某一特異性DNA序列進(jìn)行探查新技術(shù)。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第11頁微生物經(jīng)過處理后固定于另一固相表面上,經(jīng)洗滌變性后加入DNA探針進(jìn)行雜交，DNA探針能夠與同源性靶DNA進(jìn)行互補(bǔ)性結(jié)合，依據(jù)指示劑選取適當(dāng)方法進(jìn)行檢測。當(dāng)前，DNA探針技術(shù)已經(jīng)在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測中得到了應(yīng)用。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第12頁續(xù)文彬(年)針對單增李斯特氏菌hly部分基因設(shè)計探針，對腸炎沙門氏菌，大腸埃希氏菌，綠膿假單抱病菌，空腸/結(jié)腸彎曲桿菌等非單增李斯特氏菌經(jīng)雜交保護(hù)分析后，只有單增李斯特氏菌為陽性結(jié)果，含有很好特異性。薛力剛等（年）經(jīng)過吖啶酯標(biāo)識核酸探針方法檢測病原菌，核酸探針與待檢樣品中金黃色葡萄球菌rRNA序列進(jìn)行雜交，形成穩(wěn)定DNA:RNA雜交體，使用堿液破壞未雜交探針，在堿性過氧化氫中檢測發(fā)光。核酸探針法檢測金黃色葡萄球菌大大縮短了檢測周期，且特異性和敏感性較高，為金黃色葡萄球菌判定提供了一個新方法。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第13頁3.基因芯片技術(shù)基因芯片主要原理是指將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)識探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最終經(jīng)過檢測雜交信號強(qiáng)度及分布確定檢測樣品中特定微生物存在。與傳統(tǒng)微生物檢測方法相比，基因芯片技術(shù)先進(jìn)性主要表達(dá)在高通量檢測、簡便快速、敏感性高等方面，是食品安全方面重大技術(shù)突破。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第14頁

陳昱等(年)利用芯片技術(shù)對志賀氏菌等26株食源性微生物進(jìn)行檢測，最終成功建立了檢測和判定志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157方法，為3種食源性致病菌快速檢測和判定提供了準(zhǔn)確、快速、靈敏方法。賀晨等（年）篩選志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157等11種特異基因作為目標(biāo)基因，建立了一個利用多重PCR方法結(jié)合基因芯片技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測11種常見致病菌方法，為流行病學(xué)調(diào)查和傳染性疾病早期診療和判定提供了一個有效檢測伎倆。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第15頁

陸長勇（年）針對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等8種常見食源性致病菌建立了基于單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)原理基因芯片檢測方法，其靈敏度可到達(dá)0.1pg，以鼠傷寒沙門氏菌為單一檢測對象細(xì)菌純培養(yǎng)物靈敏度可到達(dá)5×102CFU/mL。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第16頁結(jié)語生物技術(shù)因其低成本、高效、高通量和高特異性等特點(diǎn)已經(jīng)滲透著食品檢測領(lǐng)域，其優(yōu)越性日趨顯著，成為未來食品安全檢測中主力軍。但每種方法難免有其不足，在應(yīng)用中需依詳細(xì)需要進(jìn)行選擇或搭配使用，也期待各種方法優(yōu)化和新技術(shù)新方法問世，從而為人們賴以生活食品提供安全和營養(yǎng)可靠保障。生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第17頁參考文件[1]李秀娟,徐保紅,田會方等.基于PCR金葡菌準(zhǔn)確檢測方法建立及應(yīng)用[J].中國人獸共患病學(xué)報,,25(5):442-445.[2]楊柳,蘇明權(quán),馬越云等.熒光定量RT-PCR檢測沙門氏菌方法建立[J].中國試驗診療學(xué),,15(1),17-20.[3]徐偉,劉軍,李素芳.單增李斯特菌與志賀氏菌多重PCR檢測技術(shù)建立[J].中國食品學(xué)報,,9(1):201-207.[4]王永,趙新，蘭青闊，朱珠,程奕.4種食源性致病菌PCR-SSCP檢測技術(shù)研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),,15(1):13-15.[5]劉成志，錢凱，李潔莉等.乳飲料中志賀氏菌快速PCR檢測技術(shù)研究[J].研究匯報,(1):1-5.生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第18頁[6]楊大偉,劉云國,譚樂義.食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測方法建立[J].食品工業(yè)科技,(6):398-400.[7]續(xù)文彬.單增李斯特氏菌液相核酸探針檢測方法建立與初步應(yīng)用.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,,28-31.[8]薛力剛,劉金華,王全凱.金黃葡萄球菌核酸探針檢測方法建立[J].中國生物制品學(xué)雜志.,23(1):91-94.[9]陳昱,潘迎捷,趙勇等.基因芯片技術(shù)檢測3種食源性致病微生物方法建立[J].微生物學(xué)通報,,36(2):285-291.[10]賀晨,孫鴻燕,邵麗筠