益生菌效果的試驗(yàn)材料與方法,農(nóng)業(yè)推廣碩士論文

益生菌效果的試驗(yàn)材料與方法,農(nóng)業(yè)推廣碩士論文本篇論文目錄導(dǎo)航：【【題目】】【【第一章】】【【第二章】】【【3.1-3.2】】益生菌效果的試驗(yàn)材料與方式方法【【3.3-3.4】】【【結(jié)論/以下為參考文獻(xiàn)】】第三章口服益生菌對(duì)血液透析病人的腸道菌群及短鏈脂肪酸的調(diào)節(jié)作用。3.1前言。腸道短鏈脂肪酸〔shortchainfattyacids，SCFAs〕是腸道菌群代謝產(chǎn)物中最主要的標(biāo)志物之一，由腸道菌群分解碳水化合物產(chǎn)生，是結(jié)腸中的基礎(chǔ)組分，是腸道內(nèi)為消化的碳水化合物[62]，具有刺激結(jié)腸收縮的功能[63]，多數(shù)研究的是乙酸、丙酸和丁酸，這三個(gè)酸是占腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的絕大部分[64。華而不實(shí)，乙酸、丙酸可被人體吸收，進(jìn)入肝臟代謝供能。丁酸作為結(jié)腸細(xì)胞的主要能量來源，可被其迅速吸收[65]，對(duì)維持結(jié)腸黏膜正常功能有重要作用，可抑制炎癥反響及致癌作用，加強(qiáng)結(jié)腸防御屏障。腸道內(nèi)SCFAs的含量多少講明了腸道菌群能否有活力，還代謝腸上皮細(xì)胞，所以短鏈脂肪酸對(duì)于腸道環(huán)境很重要。下面分別介紹這三種酸，乙酸來自于盲腸介入身體重要器官的代謝[66][67]。丙酸是為肝臟代謝提供能量的[68]。丁酸是被結(jié)腸的上皮細(xì)胞吸收利用，為結(jié)腸和盲腸提供動(dòng)力[69]，對(duì)結(jié)腸和盲腸的細(xì)胞分化和生長(zhǎng)起到了不可復(fù)制的作用[70]。腸道菌群中的厚壁菌門主要代謝產(chǎn)物就是丁酸，上述表示清楚，SCFAs對(duì)改善腸道菌群平衡及腸道功能是有重要作用的[71]，并且短鏈脂肪酸還與腸道的健康有關(guān)聯(lián)[72]。副干酪乳桿菌L9就能夠通過腸道菌群中的短鏈脂肪酸來調(diào)節(jié)腸道環(huán)境。但是該菌株對(duì)腸道內(nèi)哪種短鏈脂肪酸產(chǎn)生影響還不明確。但它提供了一種思路，就是用益生菌這類活的微生物，天天的足量攝入來到達(dá)改善腸道環(huán)境[73]，促進(jìn)腸道發(fā)育、調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。另外益生菌的代謝產(chǎn)物主要為乙酸和極少量甲酸、丙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，這些物質(zhì)可促進(jìn)腸管蠕動(dòng)，進(jìn)而產(chǎn)生通便感覺，也使腸道潤(rùn)活起來。上述這些異常感覺和狀態(tài)的改善很大原因是益生菌對(duì)腸道短鏈脂肪酸有調(diào)節(jié)作用，使腸道菌群得到改善，互相作用，有益菌也在增加，進(jìn)而能夠使腸道內(nèi)的酸堿度平衡，腸道致病菌減少[74]。有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[75]，胃腸疾病患者的糞便丁酸含量是要低于健康人的水平，但連續(xù)服用酵母菌6天后，患者糞便中的丁酸含量明顯升高，腸道內(nèi)的總SCFAs的水平也有所提高。SCFAs含量的變化成為了研究益生菌對(duì)腸道影響的重要指標(biāo)[76]。因而本章通過對(duì)食用口服益生菌的實(shí)驗(yàn)對(duì)象糞便SCFAs測(cè)定，研究口服益生菌對(duì)腸道菌群的影響。正常人腸道內(nèi)寄生著大量微生物，其至少包含500個(gè)菌種，細(xì)菌總量超過1011個(gè)，這些微生物統(tǒng)稱為腸道菌群，正常腸道菌群以雙歧桿菌、大腸桿菌、類桿菌、糞腸球菌等專性厭氧菌為主[77]。雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌與腸粘膜上皮細(xì)胞互相作用，通過與病原菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的組成，可促進(jìn)厭氧革蘭陽性菌的生長(zhǎng)，抑制革蘭陰性菌的生長(zhǎng)，并可加強(qiáng)宿主吞噬細(xì)胞的活性，加強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[78、77]。近年來，科學(xué)研究表示清楚，肥胖[79]、糖尿病[8083]、便秘以及炎癥性腸病等很多疾病都與腸道菌群相關(guān)[84]，導(dǎo)致其體內(nèi)腸道菌群存在的數(shù)量與組成形式發(fā)生明顯的改變。如美國(guó)Gordon實(shí)驗(yàn)室在肥胖關(guān)系和腸道微生物研究方面做了大量工作，他們證實(shí)腸道微生物會(huì)直接介入了宿主能量的攝取、利用和儲(chǔ)存。另外，腸道菌群也與心腦血管疾病，精神疾病，胃腸疾病等疾病有關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者認(rèn)識(shí)到人類健康和疾病與腸道菌群的密切關(guān)系，很多研究分析了腸道菌群本身以及其代謝產(chǎn)物在人體能量代謝、胃腸道功能和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等方面發(fā)揮著重要作用[85]。腸道菌群通過發(fā)酵多糖和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生小分子物質(zhì)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被腸道吸收。健康的腸道菌群通過競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)、分泌細(xì)菌素、發(fā)酵產(chǎn)酸降低腸道內(nèi)pH等，來抑制有害菌生長(zhǎng)，以維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。當(dāng)腸道完好性遭到毀壞時(shí)，有害菌大量生長(zhǎng)繁衍，可能造成細(xì)菌移位，引發(fā)感染。腸道作為人體最大的免疫器官，對(duì)免疫調(diào)節(jié)有重要作用[86]。正常的菌群與腸壁內(nèi)的淋巴細(xì)胞以腸黏膜為界限，二者互相作用并處于平衡狀態(tài)，兩者平衡若被毀壞，則會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。腸道菌群不僅可調(diào)控腸道活動(dòng)，還可影響宿主的腦功能和行為。腸道菌群通過腸-腦軸對(duì)宿主的應(yīng)激反響、焦慮抑郁、認(rèn)知能力產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而調(diào)控宿主行為。平衡的腸道菌群可促進(jìn)宿主身心健康，而失調(diào)的腸道菌群則可能引發(fā)腸-腎疾病[87]。因而研究腸道菌群的變化具有重要意義，本章將采用16s高通量測(cè)序方式方法研究口服益生菌對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象腸道菌群的變化影響。3.2材料與方式方法。3.2.1主要試劑。3.2.1.1DNA提取試劑。PBS：NaCl8.0g；Na2HPO4?12H2O2.9gKCl0.2g；KH2PO40.2g；溶于800mL去離子水，鹽酸調(diào)pH到7.4，再超純水定容到1L；121℃滅菌15min備用。10%Tris-SDS：Tris6.06g；濃鹽酸2.1mL；0.5MEDTA40mL；加40mL超純水，溶解后；調(diào)pH=9.0，定容到250mL；再加50mL10%SDS，混勻。3mol/L乙酸鈉：三水合醋酸鈉40.8g，加40mL超純水溶解，冷卻至室溫后，用冰醋酸調(diào)pH=5.2，超純水定容到100mL，121℃滅菌15min備用。氯仿:異戊醇〔24:1〕：氯仿96mL，異戊醇4mL；均勻搖擺，靜置于棕色試劑瓶中，備用。1MTris-HCl：Tris12.14g；參加超純水80mL，用濃HCl調(diào)至pH=8.0，定容至100mL，121℃滅菌15min備用。70%乙醇：70ml無水乙醇，30ml超純水。10TE緩沖液(pH8.0)：1MTris-HCl(pH=8.0)10mL;0.5MEDTA(pH=8.0)2mL，定容到100mL，滅菌，稀釋10倍使用。RNA酶RT405-02規(guī)格1ml3.2.1.2短鏈脂肪酸試劑。庚酸乙醚溶液：庚酸71L，無水乙醚定容100ml，放冰上備用。1M鹽酸備用。標(biāo)品制備：乙酸標(biāo)品2.9L、丙酸標(biāo)品3.7L、丁酸標(biāo)品4.6L、異丁酸標(biāo)品4.6L，異戊酸標(biāo)品5.5L，并用庚酸/乙醚溶液分別定容至10ml并倍比稀釋為5mM、2.5mM、1.25mM、0.625mM、0.312mM、0.156mM的各酸標(biāo)準(zhǔn)溶液放冰上備用。3.2.2主要設(shè)備。實(shí)驗(yàn)使用儀器及設(shè)備如表3-1所示：3.2.3研究樣品。樣品選取的是基線V0期和干涉兩個(gè)月V2期和干涉六個(gè)月V6期，共60個(gè)樣品。3.2.4糞便短鏈脂肪酸提取與測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟。3.2.4.1實(shí)驗(yàn)材料。乙酸、丙酸、丁酸、乙醚〔以上分析純〕，庚酸、鹽酸，2ml螺口離心管〔海門訂購〕，微量進(jìn)樣器〔藍(lán)弋〕，冰盒，容量瓶，直徑為2-3mm的玻璃珠3.2.4.2實(shí)驗(yàn)步驟?！?〕樣品預(yù)處理①準(zhǔn)備預(yù)處理管，于2ml螺口離心管內(nèi)參加適量玻璃珠，用毛細(xì)管柱FFAP參加1ml含有內(nèi)標(biāo)庚酸〔5mmol/L〕的乙醚溶液，及50l的1M鹽酸，樣品預(yù)先稱重，于-20℃保存。②參加糞便樣品〔約0.1-0.2g〕，再稱重，記錄參加糞便重量。③配平，采用minibBB破碎，30s兩次。④離心10000rpm，2min，冰上轉(zhuǎn)移上清液至新的螺口離心管。-20度保存待用。注：乙醚極易揮發(fā)，所有步驟均冰上操作，動(dòng)作迅速，及時(shí)蓋蓋，〔2〕樣品測(cè)定用自動(dòng)進(jìn)樣器汲取2l樣品進(jìn)樣，采用毛細(xì)管柱FFAP跑樣，火焰離子檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。氣相程序如下：Detect=230℃，Inject=230℃，Aux=230℃，Colomn：50℃1min，50-140℃10℃/min，140℃1min，140-240℃30℃/min，240℃2min〔3〕標(biāo)準(zhǔn)曲線制作配制含有5mmol/L乙酸、5mmol/L丙酸、5mmol/L丁酸、5mmol/L庚酸的乙醚溶液，采用倍比稀釋的方式方法，得到分別含有2.5，1.25，0.625，0.312，0.156mmol/L的乙酸、丙酸、丁酸、庚酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用〔2〕中程序跑樣，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線?！?〕短鏈脂肪酸含量計(jì)算根據(jù)上述步驟，測(cè)定得到乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸的峰面積。分別計(jì)算得到乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸與內(nèi)標(biāo)庚酸的峰面積比，將該值帶入回歸方程，即可求得樣品上清液中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸的濃度，換算后除以樣品的取樣重量可得到每毫克糞便樣品中上述五種短鏈脂肪酸的含量。3.2.516S高通量測(cè)序方式方法與步驟。3.2.5.1糞便提取DNA。〔1〕實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備工作：①將無活菌的實(shí)驗(yàn)用品及試劑放入超凈臺(tái)中，紫外燈照射。②打開低溫離心機(jī)，調(diào)到15000rpm，5min，4℃〔制冷15-20min左右〕?！?〕準(zhǔn)備器材：①1000l槍頭兩盒。②擰蓋的2ml離心管。③玻璃珠〔2ml離心管，0.3g左右〕。〔3〕實(shí)驗(yàn)步驟：〔在冰盒中進(jìn)行〕超凈臺(tái)操作〔除離心〕，使用滅菌離心管和槍頭。①取200l樣品液勻漿至擰蓋的2ml離心管。②參加1mlPBS，用漩渦振蕩器混合均勻〔或用手上下顛倒〕，離心〔15000rpm，5min，4℃〕。③棄1ml上清，重復(fù)2次。④棄1ml上清，參加0.3g左右玻璃珠，300lTris-SDS，500lTE飽和酚。⑤震蕩呈乳白色，在均質(zhì)機(jī)〔Beat-Bitter〕中均質(zhì)30s，離心〔15000rpm，5min，4℃〕。⑥將上層懸濁液400l〔2200〕轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中〔圓頭〕，分別參加400l〔酚：仿：異戊醇=25:24:1〕〔200lTris酚，200l氯仿/異戊醇〕。⑦手搖〔10-20次〕〔上下顛倒即可，輕柔〕，混勻呈白色，離心〔15000rpm，5min，4℃〕。⑧將250l〔2125〕上層懸濁液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，參加25l3M的乙酸鈉〔pH=5.3〕，參加300l異丙醇，手搖混勻后離心〔15000rpm，5min，4℃〕。⑨棄上清〔直接倒掉即可〕，參加500l70%乙醇，手搖混勻，離心〔15000rpm，5min，4℃〕。⑩棄上清〔直接倒掉即可〕，再用小離心機(jī)〔12000rpm，1min，常溫〕，用槍頭〔斜〕吸去多余液體，開蓋，室溫枯燥15min〔注意計(jì)時(shí)〕。參加100lTE，5lRNA酶，彈混〔輕〕，小離心機(jī)稍微離心〔到6000r立即停止〕，37℃恒溫箱放置10min。3.2.5.216s多樣性材料與方式方法。〔1〕測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟。①DNA抽提。根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(OmegaBio-tek，Norcross，GA，U.S.)講明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。②PCR擴(kuò)增。引物：用338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)：806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)。擴(kuò)增區(qū)域：V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，27個(gè)循環(huán)〔95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s〕，最后72℃延伸10min〔PCR儀：ABIGeneAmp?9700型〕。擴(kuò)增體系為20l，4l5*FastPfu緩沖液，2l2.5mMdNTPs，0.8l引物〔5M〕，0.4lFastPfu聚合酶；10ngDNA模板。PCR采用TransGenAP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase；PCR儀：ABIGeneAmp?9700型；全部樣本重復(fù)3遍，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，然后用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，并切膠回收PCR產(chǎn)物，用Tris-HCl緩沖液洗脫，之后進(jìn)行2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。試劑：TruSeqTMDNASamplePrepKit。③Miseq文庫構(gòu)建數(shù)據(jù)處理。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基；根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接。去除無法拼接的序列。使用的UPARSE軟件，根據(jù)97%的類似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDPclassifier()對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫〔SSU123〕，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目的區(qū)域外端；④IlluminaMiseq測(cè)序。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit進(jìn)行純化，再用Tris-HCl進(jìn)行洗脫，然后進(jìn)行2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST(Promega，USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)IlluminaMiSeq平臺(tái)(Illumina，SanDiego，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程