臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)6

臨床微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)?zāi)康膯?wèn)題22掌握抗菌藥物敏感試驗(yàn)的原理、操作方法、結(jié)果判讀及其影響因素1掌握抗酸染色法的原理、操作方法及其注意事項(xiàng)3掌握鍍銀染色及TPPA、TRUST試驗(yàn)原理、方法、結(jié)果判斷和臨床意義第1天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1個(gè)MH平板/人藥敏紙片選擇：金黃色葡萄球菌：PG、OX、VA、CLI、CIP、GEN

銅綠假單胞菌：CAZ、GEN、PIP、CIP、IMPAK

1.藥敏試驗(yàn)

2.抗酸染色什么是CLSI?什么是ATCC?美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)

ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute美國(guó)典型培養(yǎng)物（標(biāo)準(zhǔn)菌種）收藏所

AmericanTypeCultureCollection

掌握：紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理操作方法、結(jié)果判讀和影響因素熟悉：紙片擴(kuò)散法的質(zhì)量控制主要試劑和器材菌種：金葡或銅綠MH培養(yǎng)基、0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽ū葷醿x）無(wú)菌生理鹽水、各種藥物紙片等K-B藥敏法敏感試驗(yàn)將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周?chē)鷶U(kuò)散形成遞減的梯度濃度在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理

耐藥中介敏感RISLog2.MICd1d2抑菌圈直徑（mm)vMIC與抑菌圈直徑的線(xiàn)性關(guān)系紙片擴(kuò)散法材料與判斷抗菌藥物紙片：直徑6.0--6.35mm，吸水量為

20μl的濾紙。培養(yǎng)基：MH瓊脂，pH7.2--7.4，瓊脂厚度4mm菌液濃度和接種：0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?5min內(nèi)接種完畢。結(jié)果判斷與報(bào)告：S（敏感）、I（中介）、

R（耐藥）質(zhì)控：采用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥敏質(zhì)控。2023/3/99質(zhì)量控制：采用質(zhì)控菌株

腸桿菌科細(xì)菌：大腸埃希菌ATCC25922ATCC35218

銅綠假單胞菌：大腸埃希菌ATCC25922ATCC35218

銅綠假單胞菌ATCC27853

不動(dòng)桿菌等：大腸埃希菌ATCC25922ATCC35218

銅綠假單胞菌ATCC27853

葡萄球菌屬：金黃色葡萄球菌ATCC25923

大腸埃希菌ATCC35218

腸球菌屬：糞腸球菌ATCC29212

紙片擴(kuò)散法紙片擴(kuò)散法的步驟水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.2～7.4，制備成瓊脂厚度4mm，直徑90mm的平板；挑取孵育16～24小時(shí)已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。

紙片擴(kuò)散法的步驟用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液；然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度；最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無(wú)菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm。紙片擴(kuò)散法的步驟35℃孵育16～24小時(shí)量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報(bào)告敏感、中介、耐藥。藥物敏感試驗(yàn)操作示意圖①②③④⑤⑥>24>15●紙片及培養(yǎng)基要放置室溫平衡;●菌液濃度要準(zhǔn)確;●平板涂布要均勻;●各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm;●紙片中心距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm;●紙片貼上后，不能移動(dòng)。注意事項(xiàng)影響因素培養(yǎng)基的質(zhì)量藥敏紙片的質(zhì)量菌液的濃度、純度、接種菌量孵育的溫度和觀(guān)察時(shí)間操作質(zhì)量，等

分枝桿菌與抗酸染色卡介苗、抗酸染色液、玻片，等1.掌握抗酸染色的原理、方法和結(jié)果判斷。2.掌握結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)。目的要求試劑和器材細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，一般不易著色，如果經(jīng)加溫或延長(zhǎng)染色時(shí)間而著色，一旦著色，能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸酒精的脫色，所以又稱(chēng)抗酸桿菌。

抗酸染色原理涂片、干燥、紫外殺菌、固定1.初染：石炭酸復(fù)紅溶液

加熱至冒白煙5min2.媒染：

3%鹽酸酒精溶液3min3.復(fù)染：堿性美藍(lán)溶液1min結(jié)果觀(guān)察結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)抗酸染色陽(yáng)性藍(lán)色背景下菌體紅色。菌體細(xì)長(zhǎng)略彎曲有時(shí)可見(jiàn)分枝，呈單、成堆或成束排列。結(jié)核桿菌（抗酸染色）結(jié)核桿菌（抗酸染色）結(jié)核桿菌（抗酸染色）結(jié)核桿菌（抗酸染色）

培養(yǎng)基（L-J培養(yǎng)基=羅氏培養(yǎng)基）培養(yǎng)條件（專(zhuān)性需氧、較長(zhǎng)時(shí)間）菌落特征固體培養(yǎng)基---典型菌落為干燥、堅(jiān)硬、表面呈顆粒狀、乳酪色或淡黃色，形似菜花樣。結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)菜花樣菌落結(jié)核桿菌（L-J培養(yǎng)基）課后小結(jié)藥敏結(jié)果的判斷及CLSI標(biāo)準(zhǔn)抗酸染色的注意事項(xiàng)：加熱報(bào)告方式：萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)抗酸桿菌陰性(－)：連續(xù)觀(guān)察300個(gè)油鏡視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。報(bào)告抗酸桿菌菌數(shù)：1～9條/300視野?？顾釛U菌陽(yáng)性（1＋）：1～9條/100視野。抗酸桿菌陽(yáng)性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/10視野 抗酸桿菌陽(yáng)性（3＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野。抗酸桿菌陽(yáng)性（4＋）：≥10條抗酸桿菌/每視野1.K-B法藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)（1份/組）1.配制不同濃度抗菌藥物2.配制含不同濃度抗菌藥物的MH平板（共11個(gè)平板）3.點(diǎn)種金葡菌及銅綠于以上MH平板中第二天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容用刻度尺量取抑菌環(huán)直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn):敏感(susceptible,S)耐藥(resistant,R)中介(intermediate,I)藥敏結(jié)果判斷抑菌圈直徑的測(cè)量抗菌藥物紙片含藥量抑菌環(huán)直徑(mm)RIS青霉素10U≤28-≥29苯唑西林1ug≤1011-12≥13萬(wàn)古霉素30ug--≥15慶大霉素10ug≤1213-14≥15環(huán)丙沙星5ug≤1516-20≥21克林霉素2ug≤1415-20≥21金黃色葡萄球菌抗菌藥物敏感性評(píng)價(jià)抗菌藥物紙片含藥量抑菌環(huán)直徑(mm)RIS哌拉西林100ug≤17-≥18頭孢他啶30ug≤1415-17≥18亞胺培南10ug≤1314-15≥16慶大霉素10ug≤1213-14≥15環(huán)丙沙星5ug≤1516-20≥21阿米卡星30ug≤1415-16≥17銅綠假單胞菌抗菌藥物敏感性評(píng)價(jià)葡萄球菌藥敏結(jié)果解釋原理：將藥物混勻與瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度的藥物平板，使用多點(diǎn)接種器接種細(xì)菌，孵育后觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含的最低藥物濃度為MIC(minimalinhibitoryconcentration,MIC)一、目的要求（1）熟悉瓊脂稀釋法測(cè)定抗生素敏感性的原理、操作方法、結(jié)果判讀和臨床意義。（2）了解稀釋法質(zhì)量控制二、主要器材試劑

1.菌種：金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌

2.培養(yǎng)基：MH瓊脂

3.器材試劑：無(wú)菌NS、無(wú)菌蒸餾水、0.5麥?zhǔn)媳葷峁?、加樣器瓊脂稀釋法藥敏試?yàn)

原理：將不同濃度的抗菌藥物分別混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制成含不同遞減濃度藥物的平板并接種待檢菌，孵育后觀(guān)察細(xì)菌在含不同濃度藥物的平板上的生長(zhǎng)情況，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平板的最低藥物濃度為待檢菌的MIC。瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)含藥瓊脂的制備：（1）稀釋抗菌藥物：（倍比稀釋法）配制濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1280ug/ml的共11種不同濃度的藥液。（2）分別取上述藥液2ml加入內(nèi)徑為9cm的標(biāo)記平板內(nèi)。（3）再取融化后已冷至50℃左右的MH瓊脂18ml加進(jìn)平板內(nèi)，邊加加搖晃平板，使藥物和培養(yǎng)基充分混勻。另配制一塊不含藥物的平板（僅含20mlMH瓊脂）。測(cè)試菌的準(zhǔn)備：用NS校正濃度到0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用NS

稀釋10倍(100μl菌液+900μlNS)，使含菌量達(dá)到107CFU/ml。接種：在平板上劃定區(qū)域后用移液器進(jìn)行接種，接種菌量為

1--2ul，每個(gè)接種點(diǎn)含104—2×104個(gè)菌。孵育：待接種點(diǎn)菌液干后，置35℃18-24小時(shí)結(jié)果判斷：完全抑制菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該菌對(duì)檢測(cè)菌的MIC。影響因素倍比稀釋法母液12345678910111280640320160

8040201052.51.25

25603ml棄去1、往11個(gè)試管中加入3ml無(wú)菌生理鹽水3ml2、往第一個(gè)試管加入3ml2560ug/ml的CIP母液。振蕩混勻后，從第一個(gè)試管吸取3ml到第二個(gè)試管，振蕩混勻。3、從第二個(gè)試管吸取3ml到第三個(gè)試管，振蕩混勻，如此順推，得到從1280到1.25ug/ml共11支不同濃度CIP溶液。

本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測(cè)定，結(jié)果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費(fèi)時(shí)費(fèi)力。將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。如果出現(xiàn)低濃度藥物瓊脂平板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。2023/3/94444

藥物濃度

4 8 163264ug/ml制備含對(duì)倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點(diǎn)種菌，104CFU/每個(gè)點(diǎn)，孵育，判讀結(jié)果瓊脂稀釋法1.瓊脂稀釋法結(jié)果觀(guān)察2.Fontana鍍銀染色法3.TRUST試驗(yàn)和TPPA試驗(yàn)

TPPA:血清標(biāo)本：每人做；

陽(yáng)性質(zhì)控品：每組做1份

TRUST:血清標(biāo)本

陰陽(yáng)性質(zhì)控品：每人做第三天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。如果出現(xiàn)低濃度藥物瓊脂平板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。1.

涂片干燥：

在載玻片中央滴加生理鹽水一滴，用牙簽取自己的牙垢少許與生理鹽水混勻做涂片，干燥2.固定：滴加固定液，固定1分鐘后，水洗。3.媒染：滴加媒染液，加熱至冒蒸汽狀態(tài)維持30S，水洗。3.銀染：滴加硝酸銀染液，微加溫，染色約30S，水洗，自然干燥后鏡檢。

Fontana鍍銀染色法

Fontana鍍銀染色（1）固定液：冰醋酸1ml，甲醛2ml，蒸餾水100ml。（2）媒染液：鞣酸5g，石炭酸1g，蒸餾水100ml。（3）硝酸銀溶液：硝酸銀5g，蒸餾水100ml。（4）用前取銀溶液20ml，逐滴加入100g/L氫氧化銨，至產(chǎn)生棕色沉淀，輕搖后溶解，微呈乳白色。結(jié)果觀(guān)察螺旋體染成棕褐色/黑褐色。將梅毒螺旋體Nichols株的菌體成分包被在人工載體明膠粒子上致敏粒子和樣品中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合發(fā)生凝集反應(yīng)，檢測(cè)樣品中的梅毒螺旋體抗體。用于梅毒初篩試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)本的確證試驗(yàn)靈敏度高、特異性高螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）原理明膠顆粒凝集試驗(yàn)反應(yīng)原理加樣品稀釋液：第1孔至第8孔…8加25ul待檢樣本到第1孔…8稀釋樣品：第1孔至第8孔…8加入未致敏顆粒到第3孔,加入致敏顆粒從第4孔至第8孔………8加樣品稀釋液：第1孔至第8孔…8加25ul待檢樣本到第1孔…8稀釋樣品：第1孔至第8孔…8加入未致敏顆粒到第3孔,加入致敏顆粒從第4孔至第8孔………85.混勻，加蓋，靜置孵育2小時(shí)5.混勻，加蓋，靜置孵育2小時(shí)6.結(jié)果觀(guān)察陽(yáng)性：出現(xiàn)明膠顆粒凝集（++以上）陰性：不出現(xiàn)凝集

－±＋＋＋

１２３４５６７８最終稀釋倍數(shù)1:401:801:1601:3201:6401:1280-

粒子成紐扣狀聚集,呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形-/+

粒子形成小環(huán)狀,呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形+

粒子環(huán)形明顯變大,其外周邊緣不均勻且雜亂地凝集在周?chē)?/p>

++

產(chǎn)生均一的凝集,凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展++注意事項(xiàng)所有的樣品、試劑及對(duì)照品均應(yīng)作為感染性物