臨床血液學(xué)檢驗(yàn)：細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)

第二節(jié)細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)為什么要做組織化學(xué)染色火眼金睛能辨認(rèn)出什么細(xì)胞？原始淋巴細(xì)胞？原始單核細(xì)胞？原始粒細(xì)胞？其它腫瘤細(xì)胞？

細(xì)胞化學(xué)(或組織化學(xué))是組織學(xué)的一個(gè)分支，是在細(xì)胞形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上研究細(xì)胞的生物化學(xué)成分、定位、定量及代謝功能狀態(tài)的學(xué)科。細(xì)胞化學(xué)染色

CytochemicalStaining實(shí)質(zhì)是原位顯示細(xì)胞成分結(jié)構(gòu)，為不移動(dòng)有機(jī)化學(xué)物。細(xì)胞化學(xué)染色包括三個(gè)步驟：固定有色沉淀反應(yīng)復(fù)染細(xì)胞化學(xué)染色的基本步驟固定（fixation）物理法：干燥、火焰化學(xué)法：液體固定(甲醛、乙醇、甲醇、丙酮)顯示(display)：通過化學(xué)反應(yīng)形成有色沉淀顯示被測物質(zhì)。偶氮偶聯(lián)法聯(lián)苯胺法普魯士藍(lán)法雪夫反應(yīng)金屬沉淀法保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的不變使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶類、糖類等變成不溶性物質(zhì)。細(xì)胞化學(xué)染色的基本步驟復(fù)染(doublestaining)復(fù)染顏色應(yīng)與有色沉淀的顏色有明顯對比?；瘜W(xué)定量（chemicalquantitativeanalysis）定性半定量定量鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色普魯士蘭染色法（1958郁知非方法）1.原理:根據(jù)BM中含F(xiàn)e3+與蛋白質(zhì)結(jié)合較疏松，經(jīng)稀HCL處理后，呈游離Fe3+。在酸性溶液中與亞鐵氰化鉀作用后呈蘭綠色，有折光，圓形顆粒或珠、塊狀。

4Fe++++3K4[Fe(CN)6]Fe4[Fe(CN)6]3

一、鐵染色貯存鐵（鐵蛋白+含鐵血黃素），主要分布網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞外鐵骨髓小粒

幼稚紅細(xì)胞的非血紅素含鐵顆粒，又稱鐵粒幼紅細(xì)胞。分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鐵少數(shù)含小顆粒的正常成熟紅細(xì)胞稱鐵粒紅細(xì)胞鐵粒紅細(xì)胞2.鐵染色分類細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵鐵粒紅細(xì)胞3.正常范圍細(xì)胞外鐵：

+～++細(xì)胞內(nèi)鐵：

12～44%4.臨床意義⑴缺鐵性貧血（IDA）---診斷IDA及指導(dǎo)鐵劑治療的一種輔助方法。⑵鐵粒幼細(xì)胞貧血---環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞增多⑶MDS---環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞＞15%，外鐵↑⑷非缺鐵性貧血：HA、MegA、AA、多次輸血、白血病等，內(nèi)外鐵N/↑；感染、肝硬化、尿毒癥等，外鐵↑內(nèi)鐵↓缺鐵性貧血（IDA）巨幼紅細(xì)胞性貧血

內(nèi)鐵顆粒多MDS-RA、RAEB、RAEBT鐵染色

N/↓/↑

環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞（RS）大于15%---RAS診斷鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色

血細(xì)胞含有的磷酸水解酶主要

堿性磷酸酶ALP

酸性磷酸酶ACP

ALP由許多同工酶組成，在堿性條件下(最適pH為9.3～9.6)催化各種醇和酚的單磷酸酯。二、堿性磷酸酶染色鈣鈷法Gomori-Takamaish偶氮偶聯(lián)法底物:磷酸萘酚AS-MXTomonaga1963

萘酚AS-BI磷酸鈉Kaplow1963α-磷酸萘酚鈉重氮鹽:堅(jiān)固藍(lán)B固蘭RR固紫B鹽1.染色方法

Kaplow法中性粒細(xì)胞中的堿性磷酸酶在pH9.6水解磷酸萘酚鈉，釋放萘酚，后者與偶氮鹽耦合形成不溶性的染料。

2.染色原理ALP偶氮偶聯(lián)法原理陽性：中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，ALP的含量以晚幼和成熟粒細(xì)胞為最高,原粒ALP反應(yīng)陰性；網(wǎng)狀細(xì)胞強(qiáng)陽性。陰性：嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞、漿細(xì)胞及紅系細(xì)胞。3.分布4.染色分級反應(yīng)(-)0分：陰性反應(yīng)，胞漿中無陽性染色顆粒。(+)1分：胞漿少量顆粒或呈彌散淺紅色。(++)2分：胞漿中含有中等量顆?；驈浬⑹苌?+++)3分：胞漿中有豐富的顆?；驈浬⑸钌?，胞核清晰。(++++)4分：極豐富粗大顆粒，或彌散深色，胞核不清晰。NAP積分：NAP反應(yīng)結(jié)果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155積分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145陽性率為80%。細(xì)菌感染ALP染色CMLALP陰性5.ALP正常范圍陽性率:〈40%陽性指數(shù):30～130分⑴生理變化年齡：NAP活性在新生兒很高，3個(gè)月開始降低，嬰幼兒和兒童期仍略高于成年人，60歲以上老年期NAP活性降低。應(yīng)激狀態(tài)：恐懼、緊張、妊娠、分娩和劇烈運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激狀態(tài)下NAP活性可增高。性別：女性＞男性；經(jīng)前期＞行經(jīng)期6.臨床意義⑵病理變化：炎癥反應(yīng)，各種急性化膿性感染，球菌性較桿菌性感染為高；急性感染較慢性感染高。病毒性感染或寄生蟲感染、立克次體感染時(shí)ALP積分值一般正常或降低。類白血病與CML鑒別：前者中性粒細(xì)胞ALP表現(xiàn)極度增高，CML減低。ALP增高

急淋、慢淋、多發(fā)性骨髓瘤、原始神經(jīng)母細(xì)胞瘤、再障、真性紅細(xì)胞增多癥、骨髓纖維化、慢性中性粒細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤、骨髓轉(zhuǎn)移癌、原發(fā)性血小板增多癥等。

ALP降低慢粒、惡性組織細(xì)胞病、急性髓系白血病陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿。MDS正?；驕p低。

增高減低類白血病慢性粒細(xì)胞白血病慢性中性粒細(xì)胞白血病慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)菌感染病毒感染再生障礙性貧血PNH

正常減低反應(yīng)性組織細(xì)胞增多癥惡性組織細(xì)胞病

正常增高

繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥真性紅細(xì)胞增多癥繼發(fā)性血小板增多癥原發(fā)性血小板增多癥ALP鑒別意義鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色1.實(shí)驗(yàn)方法

1958年Washburn復(fù)方聯(lián)苯胺法

1965年Kaplow二鹽酸聯(lián)苯胺法

1985年血液學(xué)國際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)

二氨基聯(lián)苯胺法（DAB染色法）過氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法二鹽酸聯(lián)苯胺法三、過氧化物酶染色PeroxidaseStaining(POX)2.染色原理過氧化氫新生態(tài)氧過氧化物酶二氨基聯(lián)苯胺DBA金黃色沉淀二氨基聯(lián)苯胺法二鹽酸聯(lián)苯胺法

3.血細(xì)胞陽性程度的判斷：（-）無顆粒沉著（±）顆粒細(xì)小，分布稀疏（+）顆粒較粗常呈局灶性分布（++）顆粒粗大分布較密占胞漿1/2～2/3（+++）顆粒粗大，呈團(tuán)塊狀分布（++++）顆粒布滿細(xì)胞，可覆蓋胞核4.參考范圍⑴粒細(xì)胞系

原粒-/±，粗粒聚集狀；隨細(xì)胞成熟反應(yīng)漸強(qiáng)；衰老細(xì)胞因過氧化酶活性降低而反應(yīng)減弱;嗜酸粒細(xì)胞為強(qiáng)陽性反應(yīng);嗜堿粒細(xì)胞呈陰性或弱陽性反應(yīng)。⑵其它細(xì)胞成熟單核細(xì)胞、組織細(xì)胞呈-或±；幼紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨核細(xì)胞及血小板均為陰性反應(yīng)。5.MPO臨床意義POX主要存在于線粒體和溶酶體中，定位于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞嗜天青顆粒中。急性白血病MPO反應(yīng)強(qiáng)弱順序

M3>M2b>M2a>M6(粒)>M4>M1>M5>HAL>ALLALL和AML鑒別：ALLMPO陰性ALLL1L2L3AMLM0急性髓細(xì)胞白血病微分化型

M1急性原始粒細(xì)胞白血病未分化型

M2—M2a,M2b急性原始粒細(xì)胞白血病部分分化型M3—M3a,M3b急性早幼粒細(xì)胞白血病M4—M4a,M4b,M4c,M4Eos急性粒-單核細(xì)胞白血病M5—M5a,M5b急性單核細(xì)胞白血病M6急性紅白血病

M7急性巨核細(xì)胞白血病

急性白血病的FAB分型急性淋巴細(xì)胞白血病MPO陰性

急性混合型白血病MPO急性髓細(xì)胞白血病MPO特點(diǎn)粒系MPO：陽性反應(yīng)物顆粒粗大，聚集。單核系MPO：陽性反應(yīng)物細(xì)顆粒狀，彌散

早幼粒以下隨細(xì)胞分化成熟而↑；

特點(diǎn)：陽性物在細(xì)胞核的凹陷處聚集成團(tuán)，呈團(tuán)塊狀反應(yīng)。

M2b中異常中幼粒細(xì)胞MPO呈強(qiáng)陽性

特點(diǎn)：陽性物充滿胞漿，細(xì)胞外漿一般為陰性。

M3呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。M4MPO染色M5MPO染色急淋ALL急粒AML急單AMOL急粒APL鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色periodicacid-schiff，PAS

又名糖原染色五、過碘酸-雪夫反應(yīng)1.原理：氧化劑過碘酸把-CHOH-CHOH變成-CHO-CHO，此新生的醛基與無色堿性品紅染液（schiff）結(jié)合成紫色染料，其反應(yīng)顏色的深淺于細(xì)胞內(nèi)乙二醇基的含量成正比。

2.陽性結(jié)果

陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)粉紅色物質(zhì)。細(xì)胞核為藍(lán)色。

顆粒狀片狀珠狀塊狀

陽性率：100個(gè)計(jì)數(shù)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)陽性指數(shù)：100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞，按不同強(qiáng)度的細(xì)胞個(gè)數(shù)乘以相對應(yīng)強(qiáng)度之和。例：（+）×1+（++）×2+

（+++）×3+（++++）×4陽性率及陽性指數(shù)計(jì)算法細(xì)顆粒彌散狀

PAS為裙邊樣反應(yīng)細(xì)顆粒彌散狀見小珠

中粗顆粒散在分布PAS珠狀、塊狀呈冠狀。

3.正常血細(xì)胞染色反應(yīng)⑴粒細(xì)胞系原粒細(xì)胞多呈（±），少部分見（-）。隨細(xì)胞的成熟陽性反應(yīng)漸強(qiáng)；嗜酸粒細(xì)胞顆粒本身不著色，但顆粒間的胞漿呈彌漫粉紅色；嗜堿粒細(xì)胞為陽性，反應(yīng)物呈粗顆粒、珠狀和塊狀。⑵淋巴細(xì)胞系大多數(shù)呈（-）少數(shù)胞質(zhì)內(nèi)有少量紅色顆粒B淋巴細(xì)胞PAS正常值為陽性率＜20%⑶紅細(xì)胞系幼紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞均呈（-）。⑷巨核細(xì)胞系和血小板

（-）或（+）陽性物呈珠狀或塊狀

⑸單核細(xì)胞呈（+），陽性反應(yīng)物為細(xì)顆粒彌散狀、中粗顆粒往往位于胞漿邊緣；

⑹漿細(xì)胞大多呈（-），少數(shù)為紅色顆粒；

⑺組織細(xì)胞為（-）/（+）；

⑻巨噬細(xì)胞可呈細(xì)顆粒（+）。4.臨床意義⑴白細(xì)胞系統(tǒng)疾病的鑒別①原幼淋細(xì)胞：陰性陽性細(xì)、中粗和粗顆粒散在分布；珠狀和塊狀一個(gè)至數(shù)個(gè)成冠。②成熟淋巴細(xì)胞細(xì)、中粗、粗顆粒散在分布。

ALLPAS(-)

中粗、粗顆粒散在分布

ALLPAS珠狀③原粒及早幼粒細(xì)胞陰性或弱陽性細(xì)顆粒彌散狀

M2bPAS細(xì)顆粒彌散狀

M3④原、幼稚單核細(xì)胞陽性較粒細(xì)胞強(qiáng)細(xì)、中粗顆粒彌散狀分布，邊緣及外漿處可見粗顆粒。部分在細(xì)顆?；A(chǔ)上可見小珠；少數(shù)呈裙邊樣反應(yīng)。⑤嗜堿粒細(xì)胞PAS為強(qiáng)陽性，

陽性物多表現(xiàn)粗顆粒、珠狀、塊狀。⑵紅細(xì)胞系統(tǒng)陰性：正常人和再障。陰性：正常紅細(xì)胞、AA、CLL弱陽性：巨幼貧、溶血性貧血強(qiáng)陽性：紅白血病及各類急性白血病的幼紅細(xì)胞、MDS、IDA和重型地中海貧血。

IDAPAS

MDSPAS染色M6PAS染色鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色(Esterase)㈠酯酶分類⒈特異性酯酶:氯乙酸萘酚AS-D酯酶(NaphtholAS-Dchloroacetateesterase，NAS-DCE)⒉非特異性酯酶α-醋酸萘酯酶(Alpha-naphtholacltateesterase,α-NAE)醋酸AS-D萘酚酯酶(NaphtholAS-Dacltateasterase,NAS-DAE)α-丁酸萘酯酶(Alpha-Naphtholbutynateasterase,α-NBE)六、酯酶染色

國際血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化委員會1985年

固紫醬GBC法

新品紅方法特異性酯酶染色方法介紹1.特異性酯酶CE染色原理

細(xì)胞內(nèi)的氯乙酸萘酚酯酶，在作用液中可以將氯乙酸AS-D萘酚進(jìn)行水解，釋放氯乙酸AS-D與重氮鹽偶聯(lián)產(chǎn)生不溶性有色沉淀，定位于胞質(zhì)內(nèi)。

CE通常被看成是粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的標(biāo)志酶，分布局限，對粒細(xì)胞有較強(qiáng)的特異性。CE固紫醬GBC法

CE副品紅方法

2.正常血細(xì)胞染色反應(yīng)⑴粒系原粒細(xì)胞呈陰性反應(yīng)分化好早幼粒細(xì)胞至成熟中性粒呈陽性反應(yīng);

嗜酸粒細(xì)胞呈陰性或弱陽性反應(yīng);

嗜堿粒細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。⑵單核細(xì)胞呈陰性或弱陽性反應(yīng)。⑶淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板均呈陰性反應(yīng)。⑷組織嗜堿細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。

3.臨床意義急性白血病，陽性率強(qiáng)弱的排列順序?yàn)椋?/p>

M3>M2b>M5>M2a>M4>M6（粒）>Ml>ALL

粒系原始及早幼粒細(xì)胞一般陰性，少部分可見弱陽性反應(yīng)(+～++)。

M2b在細(xì)胞核的凹陷處呈團(tuán)塊狀反應(yīng)M3呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。易見柴束樣結(jié)晶。

單核：陰性或弱陽性，為顆粒狀散狀分布

ALLCE染色陰性

(Non-SpecificEsterase)

非特異性酯酶是一組在酸性、中性和堿性pH條件下，水解各種短鏈脂肪酸酯或芳香族酯的酶。幾乎存在于所有血細(xì)胞，包括巨核細(xì)胞、漿細(xì)胞，甚至上皮細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。該酶是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶,分布較廣泛。非特異性酯酶底物：α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)

醋酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)

α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)

重氮鹽堅(jiān)牢藍(lán)B固藍(lán)BB六偶氮付品紅

α-醋酸萘酚酯酶

α-Naphtholacetateesterase，α-NAE

1.原理:

在中性條件下，酯酶將醋酸萘酚水解，產(chǎn)生萘酚，在與重氮鹽偶聯(lián)，產(chǎn)生不溶性的有色沉淀。

不加NaF積分值-加NaF積分值NaF抑制率

=——————————————×100％

不加NaF積分值

抑制率大于50％為抑制

NaF用量15mg／10m1作用液。2.正常血細(xì)胞染色反應(yīng)⑴粒細(xì)胞系:各階段粒細(xì)胞均為-或±，隨細(xì)胞成熟陽性減弱呈陰性，不被氟化鈉抑制⑵單核細(xì)胞:陽性反應(yīng)較強(qiáng),能被氟化鈉抑制。⑶其它細(xì)胞成熟淋巴細(xì)胞部分呈陽性反應(yīng)，陽性物多表現(xiàn)為顆粒狀，不被氟化鈉抑制；巨核細(xì)胞和血小板呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；早期幼紅細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，隨幼紅細(xì)胞的成熟陽性反應(yīng)逐漸減弱，不被氟化鈉抑制。NAE正常參考結(jié)果

3.臨床意義是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶

⑴單核細(xì)胞系統(tǒng)疾病原始單核細(xì)胞呈陽性，陽性細(xì)胞呈局灶型或顆粒型反應(yīng)；少部分為陰性。幼稚單核細(xì)胞陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性。陽性物顏色鮮艷呈細(xì)小顆粒彌散狀加NaF后陽性率及指數(shù)明顯降低或陰性。原幼單核細(xì)胞NAE染色M5NAE+NaF染色⑵粒系統(tǒng)細(xì)胞疾病原始及早幼粒細(xì)胞陰性或弱陽性反應(yīng)，酶型多為彌散型、局灶型，少數(shù)可呈顆粒狀。陽性反應(yīng)不被NaF抑制。M2aNAE染色M2bNAE染色⑶淋巴細(xì)胞疾病陰性或陽性，陽性物可呈顆粒型或局灶型，在pH5.0條件下，T-淋巴細(xì)胞NSE活性顯示更為充分。有利于ALL和ANLL的鑒別。ALLNAE染色鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應(yīng)酯酶染色酸性磷酸酶染色

酸性磷酸酶染色法(ACP)

存在大部分有核細(xì)胞的胞質(zhì)，共有7種同功酶，在臨床血液學(xué)上，酸性磷酸酶反應(yīng)對診斷HCL，鑒別T-細(xì)胞型和非T細(xì)胞型淋巴增生有重要意義。是HCL所特有的，HCLACP呈陽性反應(yīng)，陽性為中等強(qiáng)度或強(qiáng)陽性反應(yīng)，并具有抗L（+）-酒石酸的功能。

T-ALLACP

B-ALLACP鐵染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（N-ALP）過氧化物酶染色（POX）蘇丹黑染色（SBB）糖原染色（PAS）特異性酯酶（CE）非特異性酯酶（N