基因克隆載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

基因克隆載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化第1頁(yè)/共29頁(yè)1.基因克隆2.連接到測(cè)序載體3.連接到表達(dá)載體4.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌5.轉(zhuǎn)化植物6.陽(yáng)性植株篩選和鑒定第2頁(yè)/共29頁(yè)1.基因克隆

PCR:低溫操作模板:cDNA或基因組DNA,可調(diào).注意換槍頭,樣品間不能污染引物:1ul/12.5ul體系,上下游引物混合,分裝PCR預(yù)混液:10ulPCR程序:根據(jù)要擴(kuò)增的長(zhǎng)度調(diào)整:

退火溫度(52-68度)

延伸時(shí)間:rTaqase:1kb/分鐘其它酶略長(zhǎng)第3頁(yè)/共29頁(yè)P(yáng)CR儀:要登記,

正確操作,

用完關(guān)掉電源,拔下電源插頭或關(guān)掉插排電源,

蓋子半蓋,

蓋上罩子第4頁(yè)/共29頁(yè)P(yáng)CR預(yù)混液(10ul),分裝,-20度保存H2OBuffer：完全化開(kāi)，分裝dNTP:低溫化開(kāi)，分裝rTaqase:最后加,低溫存放,混勻(用槍頭)（因有甘油，酶常存在底部）第5頁(yè)/共29頁(yè)電泳檢測(cè):6－10ul上樣即可加Maker（3ul）：分子量是否正確是否有非特異條帶(若有,提高退火溫度)第6頁(yè)/共29頁(yè)電泳及凝膠成像系統(tǒng)操作:

電泳緩沖液倒入專門的廣口瓶?jī)?nèi)制膠板,梳子要及時(shí)清理凝膠成像系統(tǒng)操作區(qū)為非污染區(qū),勿污染掃膠后立即關(guān)掉紫外燈圖片保存后關(guān)掉凝膠成像儀開(kāi)關(guān)最后關(guān)掉電腦第7頁(yè)/共29頁(yè)若能擴(kuò)增出分子量正確的單一條帶:1)PCR循環(huán)調(diào)為26-28個(gè)2)模板量增加3)更換保真性高的的Taqase,

如:LATaq(擴(kuò)增長(zhǎng)度1kB以上)PfuTaq(保真性最高,但需要加尾)取6ul電泳檢測(cè),剩余-20保存,連接用若用Pfu酶,則需要加尾第8頁(yè)/共29頁(yè)2.連接到測(cè)序載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌連接:按照試劑盒說(shuō)明操作連接buffer要分裝連接buffer要完全融化再用可在4度冰箱接著連接1-3天第9頁(yè)/共29頁(yè)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞:

感受態(tài)細(xì)胞要在冰上融化,上下顛倒混勻加樣在超凈臺(tái)上進(jìn)行,加樣混勻要上下顛倒,不能用槍頭混.42度熱擊溫度時(shí)間要嚴(yán)格,用溫度計(jì)標(biāo)溫度.含Amp的LB平板上加X(jué)-gal,IPTG時(shí),將IPTG加在X-gal上涂平,放在超凈臺(tái)上最后涂平板時(shí)一定要涂勻,并等到表面干燥后再用封口膜封好,倒置培養(yǎng),37度,12h左右.第10頁(yè)/共29頁(yè)陽(yáng)性菌落的鑒定挑選白色菌斑,重新在新的LBA平板上劃線培養(yǎng)12h左右.在超凈臺(tái)上用白色槍頭挑去微量菌落加入PCR混合物中,進(jìn)行PCR鑒定程序同上,30循環(huán),退火溫度降低第11頁(yè)/共29頁(yè)質(zhì)粒PCR選2-3個(gè)菌落PCR鑒定出的菌落5-6mlLB液體培養(yǎng)基(加Amp,1000倍母液)過(guò)夜,37度培養(yǎng).在超凈臺(tái)各取1ml菌于1.5ml無(wú)菌離心管內(nèi)于4度保存同時(shí)取0.5ml菌液,加入0.1ml無(wú)菌甘油,混勻,-40或－80度保存.剩余菌液用于提質(zhì)粒,用質(zhì)粒做模板,進(jìn)行PCR鑒定第12頁(yè)/共29頁(yè)注意：菌種的標(biāo)記（標(biāo)簽紙）測(cè)序載體：pMD－at1392pMD－RGT表達(dá)載體：pBI121－RGT－E（E.coli）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：pBI121－RGT－A（Agrobacteriumtumefaciems）第13頁(yè)/共29頁(yè)質(zhì)粒提取:

用前先檢查藥品和柱子是否夠用檢查相應(yīng)試劑狀態(tài)加Rnase

加乙醇澄清離心前平衡**水域鍋用完關(guān)掉**第14頁(yè)/共29頁(yè)測(cè)序選出能通過(guò)質(zhì)粒PCR擴(kuò)增出的菌液(4度保存,當(dāng)天送樣測(cè)序),用封口膜封好,填好測(cè)序單,送樣測(cè)序,保存好存根.第15頁(yè)/共29頁(yè)第16頁(yè)/共29頁(yè)DNA限制性內(nèi)切酶消化酶切

第17頁(yè)/共29頁(yè)如何做酶切反應(yīng)？

正確使用和保存酶:酶需要保存在-20度的低溫環(huán)境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來(lái)，取酶時(shí)放于冰上。手拿酶管時(shí)不要接觸酶管下部含酶的部分，用完后需要及時(shí)送回原處。加酶后用槍頭充分混勻（內(nèi)含甘油）注意：酶通常是最后加。第18頁(yè)/共29頁(yè)模板DNA:純度:充分去除雜質(zhì),用含有去蛋白試劑的試劑盒,DNA樣品中不能含有有機(jī)溶劑（提取質(zhì)粒時(shí)不能有乙醇?xì)埩?washbuffer)濃度：濃度過(guò)高，溶液黏度過(guò)大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會(huì)好。濃度過(guò)低，酶切產(chǎn)物不夠.提取質(zhì)粒后取5ul電泳,確定濃度第19頁(yè)/共29頁(yè)反應(yīng)體積:酶切鑒定20ul,需要回收連接則相應(yīng)擴(kuò)大體系最后加酶混勻:（因有甘油，酶常存在底部）需要用槍頭小心混勻幾次,甩到管底。不能使用振蕩器混勻。反應(yīng)時(shí)間:3-4h。第20頁(yè)/共29頁(yè)雙酶切酶切buffer:平衡兩種酶酶切溫度:酶切時(shí)間:酶切效率酶切體系:1ul酶/20ul體系

第21頁(yè)/共29頁(yè)酶切后電泳,回收電泳:更換新的電泳緩沖液膠:濃度低的膠,厚,上樣量盡量多切膠:選準(zhǔn)片段,快,減少紫外注射的時(shí)間切膠:盡量去除多余的無(wú)樣的膠第22頁(yè)/共29頁(yè)回收：膠要充分溶解，注意:EB污染手,槍等用20-25ul兩次沖洗,共得到20ul左右電泳:3－5ul上樣，加相同量的Maker,確定濃度第23頁(yè)/共29頁(yè)電泳判斷大小片段濃度時(shí)，應(yīng)考慮其自身分子量的差異第24頁(yè)/共29頁(yè)反應(yīng)必須于16℃進(jìn)行。當(dāng)連接反應(yīng)難以進(jìn)行時(shí)，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。4度延長(zhǎng)連接時(shí)間。第25頁(yè)/共29頁(yè)如何提高連接的效率，防止假陽(yáng)性的產(chǎn)生？連接前使用堿性磷酸酶，去除載體