細胞工程原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細胞雜交詳解演示文稿

細胞工程原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細胞雜交詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共84頁。（優(yōu)選）細胞工程原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細胞雜交當(dāng)前2頁，總共84頁。第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細胞雜交當(dāng)前3頁，總共84頁。原生質(zhì)體的概念植物原生質(zhì)體（protoplast）是指除去了細胞壁后的裸露的球形細胞。當(dāng)前4頁，總共84頁。

原生質(zhì)體能進行植物細胞的各種基本生命活動，如蛋白質(zhì)和核酸合成、光合作用、呼吸作用以及通過質(zhì)膜的物質(zhì)交換等，這極有利于探討許多細胞生理問題。同時，由于原生質(zhì)體在誘導(dǎo)條件下能發(fā)生融合，離體培養(yǎng)條件下可能再生植株。因此原生質(zhì)體培養(yǎng)研究在理論上和實踐上都具有重要意義。原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本原理當(dāng)前5頁，總共84頁。原生質(zhì)體培養(yǎng)的發(fā)展歷程：-1880年，Hanstein首次使用原生質(zhì)體protoplast一詞-1960年，Cocking首次采用纖維素酶從番茄幼苗的根尖中分離原生質(zhì)體獲得成功-1971年，Takebe等首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株-1985年，F(xiàn)ujimura等獲得第一例禾谷類作物－-水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株-1986年，Spangenberg等利用單個原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株，在甘藍型油菜上獲得成功當(dāng)前6頁，總共84頁。據(jù)統(tǒng)計，自1971年Takebe首次報道從煙草葉肉原生質(zhì)體再生植株后，已有49個科160多個屬的360多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株。其趨勢仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟作物為主，但已開始從一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物擴展。當(dāng)前7頁，總共84頁。原生質(zhì)體的制備優(yōu)點：條件溫和，原生質(zhì)體完整性好，得率高等。（一）原生質(zhì)體的分離--酶解法影響因素：供試材料，酶的種類、濃度以及其組合，酶液滲透壓，酶解時間和溫度，純化方法當(dāng)前8頁，總共84頁。

1、材料的來源當(dāng)前9頁，總共84頁。實踐證明，幼嫩葉片，萌發(fā)種子的下胚軸、子葉以及愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物等均是原生質(zhì)體的良好來源：--葉肉細胞是分離原生質(zhì)體的較好材料，從葉片中可分離出大量的較均勻一致的原生質(zhì)體。由葉片制備原生質(zhì)體時，植株的年齡和生長條件十分重要一般選用植株上充分展開的葉片；--愈傷組織和懸浮細胞系，由于其生長快速穩(wěn)定，受環(huán)境條件的影響不大容易獲得大量高質(zhì)量的原生質(zhì)體。細胞系建立時間的長短，繼代培養(yǎng)的時間和培養(yǎng)基的成分等都影響原生質(zhì)體分離的數(shù)量和質(zhì)量。一般選用結(jié)構(gòu)疏松并處于對數(shù)生長期的細胞分離原生質(zhì)體的效果較好。

當(dāng)前10頁，總共84頁。外植體材料用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射以及預(yù)培養(yǎng)等方法，可以提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同：--龍膽試管苗只有用4℃處理后分離的原生質(zhì)體才能分裂；--甘蔗植株只有在黑暗條件下培養(yǎng)12小時后分離的原生質(zhì)體才能分裂；--馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48小時后分離原生質(zhì)體，才會獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量。

2、預(yù)處理及酶解當(dāng)前11頁，總共84頁。

酶酶解滲透壓調(diào)節(jié)劑當(dāng)前12頁，總共84頁。酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類onozukaR–10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA原生質(zhì)體分離常用的商品酶當(dāng)前13頁，總共84頁。當(dāng)前14頁，總共84頁。甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等--調(diào)節(jié)酶液滲透壓，使其與所處理細胞的滲透壓相似，保證原生質(zhì)體活力，使用濃度根據(jù)植物材料而異，一般在0.2~0.8mol/LCaCl2·2H2O，KH2PO4，MES（2-氮嗎啉乙烷磺酸），葡聚糖硫酸鉀--提高原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性AgNO3、過氧化物歧化酶(SOD)--減輕酶解時產(chǎn)生的乙烯、氧自由基對細胞膜的損傷

牛血清蛋白

--可防止細胞壁降解過程中對細胞膜和細胞器的破壞當(dāng)前15頁，總共84頁。酶解時間酶濃度酶解溫度利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時間獲得大量而有活力的原生質(zhì)體！當(dāng)前16頁，總共84頁。酶解過程一般為將酶解材料放入裝有酶液的培養(yǎng)皿中進行酶解，或在靜止條件下每隔一段時間輕輕搖動，或?qū)⑴囵B(yǎng)皿放在30～50r/min的搖床上輕輕振蕩以游離原生質(zhì)體。應(yīng)注意以下條件：a、植物材料應(yīng)按比例和酶液混合，才能有效地游離原生質(zhì)體b、不同材料其生理特性不同，對酶液中滲透壓的要求也不同c、酶的種類、濃度和酶解時間因材料而異d、酶液pH值一般在5.4～6.0e、酶解溫度控制在24～28℃左右f、黑暗或弱光下進行

當(dāng)前17頁，總共84頁。當(dāng)前18頁，總共84頁。

（二）原生質(zhì)體的純化因植物材料和所使用的滲透壓穩(wěn)定劑不同，進一步純化方法有：1、沉降法2、漂浮法3、梯度離心法當(dāng)前19頁，總共84頁。沉降法方法：將收集的濾液低速離心，使原生質(zhì)體沉降于管底。轉(zhuǎn)速的控制以將原生質(zhì)體沉淀而細胞碎片等雜質(zhì)仍懸浮在上清液中為準，一般為500～800r/m下離心3～5min。用吸管小心地吸取上清液，再用洗滌液洗原生質(zhì)體3次，最后用培養(yǎng)基洗滌1次，調(diào)整到一定密度后進行培養(yǎng)。--純化收集方便，操作簡單，原生質(zhì)體丟失少。--在漂洗過程中容易造成原生質(zhì)體的損傷，并且純度不夠好，存在少量脫壁不完全的細胞和破碎的原生質(zhì)體。當(dāng)前20頁，總共84頁。漂浮法方法：將收集的濾液于1000r/m的轉(zhuǎn)速下離心10min，原生質(zhì)體將漂浮于溶液的表面，細胞碎片等雜質(zhì)將下沉到管底。用吸管吸出原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)入到另一離心管中，反復(fù)3次，用培養(yǎng)基洗滌1次后調(diào)整到所需密度進行培養(yǎng)。--可以收集到較為純凈的原生質(zhì)體，并且可以避免在離心純化過程中因振蕩撞擊或擠壓引起的原生質(zhì)體破裂或損傷。--原生質(zhì)體在數(shù)量上損失較多。當(dāng)前21頁，總共84頁。界面法－梯度離心法方法：采用兩種比重不同的溶液，離心后使完整無損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間,而細胞碎片等雜質(zhì)沉于管底。用此法可獲得更為純凈的原生質(zhì)體。當(dāng)前22頁，總共84頁。以柑桔為例：25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液當(dāng)前23頁，總共84頁。當(dāng)前24頁，總共84頁。（三）原生質(zhì)體活力的測定

1.熒光素雙醋酸酯(FAD)染色法2.酚藏花紅染色法3.熒光增白劑染色法4.伊凡藍染色法當(dāng)前25頁，總共84頁。二乙酸熒光素(fluoresceindiacetate,FDA)染色法

FDA本身無熒光，無極性，能透過細胞質(zhì)膜，一旦進入原生質(zhì)體后能在內(nèi)酯酶作用下分解形成有熒光的極性物質(zhì)－熒光素?zé)晒馑夭荒茏杂纱┰郊毎|(zhì)膜而積累在原生質(zhì)體當(dāng)中，在熒光顯微鏡下觀察時，凡發(fā)淡綠色熒光的是有活力的原生質(zhì)體，無熒光或熒光很微弱的已經(jīng)死亡或活力低的原生質(zhì)體。當(dāng)前26頁，總共84頁。

原生質(zhì)體的培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)基

原生質(zhì)體培養(yǎng)方法

愈傷組織形成和植株再生

影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素

當(dāng)前27頁，總共84頁。1.無機鹽大量元素濃度；NO3-與NH4+的比例；Ca2+濃度2.有機成分維生素、氨基酸、糖及糖醇、酵母提取物、水解酪蛋白3.激素：生長素先高到低4.滲透壓：培養(yǎng)基滲透壓和細胞滲透壓等滲原生質(zhì)體培養(yǎng)基

當(dāng)前28頁，總共84頁。當(dāng)前29頁，總共84頁。液體淺層培養(yǎng)過程：將原生質(zhì)體以一定密度懸浮在培養(yǎng)液中，用吸管將原生質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿或三角瓶中使成一薄層。膜密封后置于人工培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。優(yōu)點：操作簡便，對原生質(zhì)體傷害小，通氣性好，代謝物易擴散易于補充新鮮培養(yǎng)基，形成細胞團或小愈傷組織后易于轉(zhuǎn)移，較廣泛采用。缺點：原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中分布不均勻，常發(fā)生原生質(zhì)體間的黏連現(xiàn)象或造成局部密度過高，從而影響原生質(zhì)體再生細胞的進一步發(fā)育，并且難以定點觀察和跟蹤單個原生質(zhì)體的生長發(fā)育過程。當(dāng)前30頁，總共84頁。固體培養(yǎng)－－瓊脂（糖）平板培養(yǎng)或包埋培養(yǎng)過程：將原生質(zhì)體懸浮液與35℃的瓊脂（糖）培養(yǎng)基等量混合，使瓊脂（糖）最終濃度為0.6%左右，迅速并輕輕搖動使原生質(zhì)體均勻分布，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，冷卻后原生質(zhì)體包埋在瓊（糖）培養(yǎng)基中，封口后培養(yǎng)。優(yōu)點：原生質(zhì)體被彼此分開并固定位置，便于定點觀察，跟蹤單個原生質(zhì)體發(fā)育過程，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體的分裂頻率和植板率；同時避免了細胞間有害代謝產(chǎn)物的影響。缺點：對操作要求較嚴，在原生質(zhì)體懸浮液與瓊脂（糖）培養(yǎng)基混合時溫度必須合適，太高會影響原生質(zhì)體活力，太低培養(yǎng)基的凝固較快使得原生質(zhì)體分布不均勻；并且原生質(zhì)體的生長發(fā)育比液體淺層法慢。已較少采用。當(dāng)前31頁，總共84頁。液體淺層-固體平板雙層培養(yǎng)法過程：在培養(yǎng)皿的底部鋪一薄層含瓊脂（糖）的固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液加于固體培養(yǎng)基表面進行液體淺層培養(yǎng)。優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以緩慢地釋放到液體培養(yǎng)基中，補充培養(yǎng)物對營養(yǎng)的消耗。同時，如在下層培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可有效地吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂及細胞團的形成。缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。當(dāng)前32頁，總共84頁。瓊脂糖珠培養(yǎng)過程：將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ul一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后，向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。優(yōu)點：可通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于原生質(zhì)體進一步生長和發(fā)育。由于改變了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而可促進原生質(zhì)體的分裂及細胞團的形成。當(dāng)前33頁，總共84頁。飼養(yǎng)層培養(yǎng)-看護培養(yǎng)、滋養(yǎng)培養(yǎng)

過程：該法又可分為分層培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。分層培養(yǎng)是先制備固體的飼養(yǎng)細胞層，再在其上植板培養(yǎng)層。用x射線照射部分分離的原生質(zhì)體，照射后將原生質(zhì)體洗2～3次，包埋于瓊脂培養(yǎng)基中，然后鋪于培養(yǎng)皿的底層構(gòu)成飼養(yǎng)細胞層。將欲培養(yǎng)的有活力的原生質(zhì)體植板于飼養(yǎng)細胞層上面進行培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)是將經(jīng)過x射線照射而失去分裂能力的原生質(zhì)體與有活力的原生質(zhì)體相混合，并包埋于瓊脂培養(yǎng)基中進行固體平板法培養(yǎng)。優(yōu)點：適合于原生質(zhì)體低密度培養(yǎng)和某些難以培養(yǎng)的植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)。當(dāng)前34頁，總共84頁。當(dāng)前35頁，總共84頁。培養(yǎng)條件主要指培養(yǎng)的光照和溫度。原生質(zhì)體培養(yǎng)對培養(yǎng)條件的要求十分嚴格，且不同來源的原生質(zhì)體在不同的培養(yǎng)階段有不同要求。一般來說：--新分離原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化階段再置于光下培養(yǎng)，光強1000～3000lx，光周期每天10～16h--不同的植物原生質(zhì)體培養(yǎng)對溫度的要求不盡相同，一般為25～30℃當(dāng)前36頁，總共84頁。細胞壁再生細胞分裂愈傷組織形成植株再生

愈傷組織形成和植株再生

當(dāng)前37頁，總共84頁。--原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細胞壁。--電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后新壁開始形成，先是由質(zhì)膜合成形成細胞壁的主要成分微纖維，然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進行聚合作用產(chǎn)生多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜與片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團，最后形成完整的細胞壁。(1)細胞壁再生當(dāng)前38頁，總共84頁。--原生質(zhì)體一般培養(yǎng)2～7d后開始第一次分裂，此時間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。--用幼苗的下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細胞和未成熟種子的子葉等為材料分離的原生質(zhì)體，一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快。(2)細胞分裂和生長當(dāng)前39頁，總共84頁。--大多數(shù)情況下，原生質(zhì)體培養(yǎng)二周后形成多細胞細胞團，三周后形成肉眼可見的小細胞克隆，大約六周后形成直徑1mm的小愈傷組織。--原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10天后必需及時添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細胞團不繼續(xù)生長，待小愈傷組織長至1mm左右時應(yīng)及時轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進一步生長。(3)愈傷組織的形成當(dāng)前40頁，總共84頁。--原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可進一步成苗。越來越多實驗證明，兩步成苗法更適合大多數(shù)植物原生質(zhì)體再生植株。即，首先將愈傷組織培養(yǎng)于低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)再轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。(4)植株再生當(dāng)前41頁，總共84頁?；蛐驮|(zhì)體的來源起始培養(yǎng)密度和培養(yǎng)基影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素

當(dāng)前42頁，總共84頁。當(dāng)前43頁，總共84頁。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)程序示意圖原生質(zhì)體分離⑴機械法分離原生質(zhì)體⑵酶法分離⑶影響原生質(zhì)體活力的因素原生質(zhì)體純化⑴沉降法⑵漂浮法⑶界面法原生質(zhì)體培養(yǎng)⑴平板培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)法⑵細胞密度104~105個/mL（因種類而異）⑶培養(yǎng)成功的關(guān)鍵細胞壁再生⑴植物種類和材料的生理狀態(tài)⑵培養(yǎng)細胞所處時期（旺盛分裂期則快）⑶與質(zhì)膜穩(wěn)定劑和滲透壓穩(wěn)定劑有關(guān)細胞分裂形成細胞團⑴基本培養(yǎng)基篩選⑵激素種類和濃度調(diào)節(jié)⑶滲透壓調(diào)節(jié)器官形成植株再生⑴基本培養(yǎng)基無機鹽濃度篩選⑵激素種類和濃度調(diào)節(jié)⑶滲透壓調(diào)節(jié)當(dāng)前44頁，總共84頁。當(dāng)前45頁，總共84頁。原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：1、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體培養(yǎng)成功為開展體細胞雜交奠定了基礎(chǔ)，通過不同材料的原生質(zhì)體融合克服傳統(tǒng)育種方法所面臨的生殖障礙，創(chuàng)造新的種質(zhì)材料。2、篩選突變體原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生體細胞無性系變異，且對外界理化因子更為敏感易誘發(fā)突變，可從中選出具有優(yōu)良性狀的變異體，成為農(nóng)作物改良的重要遺傳資源。當(dāng)前46頁，總共84頁。3、遺傳轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體容易攝取外源遺傳物質(zhì)，如細胞器、細胞核、細菌、病毒、質(zhì)粒和各種DNA分子，使其能夠作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。目前，PEG法、電激法、脂質(zhì)體法、基因槍法等均已用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究，獲得了大豆等一系列轉(zhuǎn)基因植株

4、基礎(chǔ)研究原生質(zhì)體為細胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細胞生理學(xué)、病毒學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)理論研究提供了理想的實驗體系，可用于研究細胞壁再生、細胞膜的結(jié)構(gòu)及離子轉(zhuǎn)運、細胞器的光合作用、呼吸作用等。當(dāng)前47頁，總共84頁。當(dāng)前48頁，總共84頁。體細胞雜交(somatichybridization)是指兩個離體細胞通過一定的誘導(dǎo)技術(shù)使質(zhì)膜接觸而融合在一起，隨后導(dǎo)致兩個細胞核物質(zhì)融合的技術(shù)。植物體細胞雜交則是指除去細胞壁的原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)。一、體細胞雜交的概念當(dāng)前49頁，總共84頁。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)。在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA，亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。理論上說，任何細胞都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠意義。當(dāng)前50頁，總共84頁。對稱融合（asymmetricfusion）－即兩個完整的細胞原生質(zhì)體融合。非對稱融合（symmetricfusion）－利用物理或化學(xué)的方法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再進行融合，它可以分為幾種：

根據(jù)融合時細胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大類：當(dāng)前51頁，總共84頁。目前開展的融合試驗中絕大部分是對稱融合，此融合方式在獲得農(nóng)藝性狀互補的體細胞雜種方面具有一定的優(yōu)勢，但由于它綜合了雙親的全部性狀，在導(dǎo)入有利性狀同時也不可避免帶入了一些不利性狀。尤其在一些遠緣組合中，由于存在一定程度的體細胞不親和性，使得雜種植株的表現(xiàn)并非預(yù)期理想。

對稱融合當(dāng)前52頁，總共84頁。

首例非對稱雜種是由x射線輻射處理后的歐芹原生質(zhì)體與煙草原生質(zhì)體相融合得到的。這一融合方法由于在轉(zhuǎn)移部分遺傳物質(zhì)方面具有獨特優(yōu)點而受到重視。非對稱融合當(dāng)前53頁，總共84頁。物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有:核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活的目的）用于細胞核或細胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩類：當(dāng)前54頁，總共84頁。二、原生質(zhì)體的融合（一）原生質(zhì)體融合方法PEG融合電融合當(dāng)前55頁，總共84頁。PEG誘導(dǎo)融合：1制備原生質(zhì)體懸浮液；2混合好的原生質(zhì)體懸浮液中逐滴加入PEG溶液，可在倒置顯微鏡下觀察；3將PEG中的原生質(zhì)體于室溫下保溫15～20min；4待大多數(shù)細胞圓球化，再在原生質(zhì)體懸浮液滴頂部加一滴高鈣溶液，靜置10～20min；5用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌，500r/m離心去除融合液，培養(yǎng)原生質(zhì)體。當(dāng)前56頁，總共84頁。由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵當(dāng)PEG分子鏈足夠長時，在相鄰原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連與膜相連的PEG分子被洗掉后，膜上電荷發(fā)生紊亂而重新分配另外，PEG能增加類脂膜的流動性，使原生質(zhì)體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能

PEG融合的機理：當(dāng)前57頁，總共84頁。-+-+-橋梁++--PEG被洗掉++--電荷重排++--原生質(zhì)體膜接觸++-融合當(dāng)前58頁，總共84頁。融合成本低，勿需特殊設(shè)備融合子產(chǎn)生的異核率較高融合過程不受物種限制融合過程繁瑣PEG可能對細胞有毒害PEG融合的特點：當(dāng)前59頁，總共84頁。電融合誘導(dǎo)法：1、將已制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室中；2、微電極型的兩個電極的端部同時與兩靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，所產(chǎn)生的5～12mA的脈沖電流間斷刺激1～5ms，原生質(zhì)體瞬時發(fā)生暫時性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個個泡囊，最后形成融合體；3、平行多電極通過1MHz的交流電場發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力作用下極化產(chǎn)生偶極子原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀，在直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進一步形成融合體。當(dāng)前60頁，總共84頁。1細胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；2膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖后就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起電融合的基本過程：當(dāng)前61頁，總共84頁。電融合法的原理交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠負極正極--+-++++--+-+-+-+-+-+-當(dāng)前62頁，總共84頁。施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-當(dāng)前63頁，總共84頁。當(dāng)前64頁，總共84頁。--交流電壓--交變電場的振幅頻率--交變電場的處理時間--直流高頻電壓--脈沖寬度--脈沖次數(shù)電融合中的主要參數(shù)：當(dāng)前65頁，總共84頁。一是不存在對細胞的毒害問題二是融合效率高三是融合技術(shù)操作簡便與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點：當(dāng)前66頁，總共84頁。交流電使原生質(zhì)體排成串珠

直流電使原生質(zhì)體質(zhì)膜發(fā)生不可逆擊穿電融合儀的結(jié)構(gòu)特點：一是交變電場部分一是高頻直流電擊部分當(dāng)前67頁，總共84頁。（二）原生質(zhì)體融合過程1、凝聚作用階段，其間兩個或兩個以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2、在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個原生質(zhì)體之間細胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋；3、由于細胞質(zhì)橋的擴展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。當(dāng)前68頁，總共84頁。原生質(zhì)體質(zhì)量融合方法融合參數(shù)(三)影響原生質(zhì)體融合的因素當(dāng)前69頁，總共84頁。雜種細胞的發(fā)育動態(tài)雜種細胞的選擇系統(tǒng)與體細胞雜種植株的鑒定體細胞雜種的特點體細胞雜種后代的遺傳三、雜種細胞的發(fā)育動態(tài)及體細胞雜種鑒定當(dāng)前70頁，總共84頁。（一）雜種細胞的發(fā)育動態(tài)核融合核質(zhì)重組細胞器重組部分核物質(zhì)或細胞器丟失融合核分裂當(dāng)前71頁，總共84頁。（二）雜種細胞的選擇系統(tǒng)與體細胞雜種植株的鑒定1、雜種細胞的選擇系統(tǒng)外觀選擇互補選擇熒光標記選擇當(dāng)前72頁，總共84頁。大豆根間懸浮培養(yǎng)細胞的+粉藍煙草葉肉細胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體

異核體具有濃厚細胞質(zhì)的非綠色綠色、液泡化（1）利用天然顏色標記分離雜種細胞：既具有粉藍煙草原生質(zhì)體特有的綠色質(zhì)體又具有與大豆原生質(zhì)體相似的形態(tài)和豐富的細胞質(zhì)帶當(dāng)前73頁，總共84頁。Galbraith等用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素（FITC）和發(fā)紅色熒光的堿性蕊香紅熒光素分別標記了兩種煙草的葉肉原生質(zhì)體，有效選擇出了雜種細胞。（2）利用熒光素標記分離